Charakterisierung des Serumproteoms bei Patienten mit Prader-Willi-Syndrom (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Methoden Studiendesign Die Studie umfasst zwei Phasen, eine erste explorative Phase, die als „Discovery“ bekannt ist, in der 30 Probanden mit Prader-Willi-Syndrom (PWS) mit der SOMAscan-Technologie analysiert werden, um ein Serum-Proteomik-Profil zu erstellen. Die hepatische Steatose wird durch die Verwendung von Abdomen-Ultraschall bei PWS-Probanden bestimmt, indem die Kontrollgruppe (Steatosegrad 0/1) und die steatotische Gruppe (Steatosegrad 2/3) gebildet werden. Anschließend werden in den 30 Proben, die in der Entdeckungsphase verwendet wurden (Proben, die bereits in unserer Serumbank vorhanden sind), und weiteren 22 Proben von PWS-Patienten, die speziell für diese Studie aufgenommen wurden, mindestens zwei Kandidaten-Biomarker ausgewählt und durch ELISA validiert.

Patienten:

30 Probanden, die bereits in unserem vorherigen MIRNOMAPWS-Projekt (RC-2018) mit genetischer Diagnose von PWS rekrutiert wurden, beiderlei Geschlechts und im Alter zwischen 18 und 45 Jahren unter Ausgangsbedingungen, werden berücksichtigt.

Für jeden Patienten werden die folgenden Variablen aus den Krankenakten erhoben:

• Anthropometrische Parameter (Größe, Gewicht, BMI, Taillenumfang);
• Körperzusammensetzung (Magermasse, Fettmasse) unter Verwendung der Impedanzmesstechnik (BIA);
• Grade der Steatose, gemessen mit Ultraschall nach Standardkriterien
• Grundstoffwechsel mittels indirekter Kalorimetrie;
• biochemische Parameter, die das metabolische Syndrom bestimmen (HDL-Cholesterin, Triglyceride, Blutzucker);
• Blutdruck;
• begleitende Hormontherapien (Wachstumshormontherapie, Sexualsteroide und/oder L-Thyroxin).

Serumentnahme für die Proteomikanalyse: Die Proteomikanalyse wird an den 30 bereits verfügbaren Proben (die für die „Discovery“-Phase verwendet werden) und an 22 neuen Patienten durchgeführt. Ähnlich wie beim MIRNOMAPWS-Projekt (RC-2018) werden Nüchternblutproben neuer Patienten durch standardmäßige Venenpunktion in BD Vacutainer®-Serumtrennröhrchen (BD – Plymouth PL6 7BP, UK) entnommen und bei 1900 g und 4 °C zentrifugiert C für 10 min und bei 16.000 g bei 4°C für weitere 10 min. Die Überstände wurden zur Langzeitlagerung bei –80°C eingefroren.

Proteomanalyse: Vor der Proteomanalyse wird das Vorhandensein von Hämoglobin durch das Spektrophotometer Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) unter Verwendung des direkten spektrophotometrischen Verfahrens von Harboe mit Allen-Korrektur bewertet: Hb (g/L) = (167, 2 × A415 – 83,6 × A380 – 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / Verdünnung in dH2O. Der für Serum in Betracht gezogene Grenzwert beträgt 0,020 g/l.

Für die proteomische Charakterisierung von Serum wird eine neue Hochdurchsatz-Omics-Technologie basierend auf der SomaLogic SOMAscan-Plattform verwendet. Das System basiert auf dem Nachweis von SOMAmeren (Slow Off-rate Modified Aptamers), bei denen es sich um aptamere DNA-Formen mit hoher Affinität und Spezifität für das Zielprotein handelt. Darüber hinaus sind diese Aptamere resistent gegen Nukleotidase-Aktivität und zeigen eine höhere Affinität als normale Antikörper. Das in dieser Studie verwendete Panel wird es uns ermöglichen, 1500 Proteinziele zu bewerten, die an der Entwicklung von Stoffwechselerkrankungen beteiligt sind, Teil der allgemeinen Entzündungsreaktion sind und für die Untersuchung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Onkologie von Interesse sind.

Im Allgemeinen sind die Empfindlichkeit und Leistung des Tests mit denen eines normalen ELISA-Kits vergleichbar, mit Grenzen für die Quantifizierung um 100 fM und Nachweis von 40 fM und dem Bedarf von nur 65 µl der Probe.

Validierung der Kandidaten durch ELISA: In dieser Phase werden mindestens zwei der in der Entdeckungsphase identifizierten Marker validiert, die in multiparametrischen Korrelationsanalysen einen signifikanten Zusammenhang mit der Steatosezunahme gezeigt haben. Die Validierung erfolgt durch Quantifizierung der Kandidaten in den Serumproben unter Verwendung spezifischer kommerzieller ELISA-Kits vom Sandwich-Typ. Wie im vorherigen Abschnitt erwähnt, werden insgesamt 52 Proben gemessen, von denen 30 für die Entdeckungsphase (bereits gespeicherte Seren) und weitere 22 neue Proben von Probanden, die für die Validierungsphase eingeschrieben sind, aufgenommen wurden.