Karakterisering van serumproteoom bij proefpersonen met het Prader Willi-syndroom (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Methoden Onderzoeksopzet Het onderzoek omvat twee fasen, een eerste verkennende fase, bekend als "ontdekking", waarin 30 proefpersonen met het Prader-Willi-syndroom (PWS) zullen worden geanalyseerd met SOMAscan-technologie om een ​​serum-proteomisch profiel uit te voeren. Hepatische steatose zal worden bepaald door het gebruik van abdominale echografie bij PWS-patiënten door de controlegroep (steatose graad 0/1) en de steatotische groep (steatose graad 2/3) vast te stellen. Vervolgens zullen ten minste twee kandidaat-biomarkers worden geselecteerd en gevalideerd door ELISA in de 30 monsters die in de ontdekkingsfase zijn gebruikt (monsters die al aanwezig zijn in onze serumbank) en nog eens 22 monsters van PWS-patiënten die specifiek voor deze studie zijn ingeschreven.

Patiënten:

Er zal rekening worden gehouden met 30 proefpersonen die al zijn aangeworven in ons vorige MIRNOMAPWS-project (RC-2018) met genetische diagnose van PWS, van beide geslachten en tussen 18 en 45 jaar in basiscondities.

Voor elke patiënt worden de volgende variabelen uit de medische dossiers verzameld:

• antropometrische parameters (lengte, gewicht, BMI, middelomtrek);
• lichaamssamenstelling (vetvrije massa, vetmassa), met behulp van de impedantiemeettechniek (BIA);
• niveaus van steatose gemeten met echografie volgens standaardcriteria
• basismetabolisme, met behulp van indirecte calorimetrie;
• biochemische parameters die het metabool syndroom bepalen (HDL-cholesterol, triglyceriden, bloedsuiker);
• bloeddruk;
• gelijktijdige hormonale therapieën (groeihormoontherapie, geslachtshormonen en/of l-thyroxine).

Serumverzameling voor proteoomanalyse: de proteoomanalyse zal worden uitgevoerd op de 30 reeds beschikbare monsters (gebruikt voor de "ontdekkingsfase") en op 22 nieuwe patiënten. Vergelijkbaar met wat werd gedaan voor het MIRNOMAPWS-project (RC-2018), zullen nuchtere bloedmonsters van nieuwe patiënten worden verzameld door middel van standaard aderpunctie in BD Vacutainer®-serumscheidingsbuizen (BD - Plymouth PL6 7BP, VK) en gecentrifugeerd bij 1900 g bij 4 ° C gedurende 10 min en bij 16.000 g bij 4°C nog eens 10 minuten. De supernatanten werden ingevroren bij -80°C voor langdurige opslag.

Proteomische analyse: vóór de proteomische analyse zal de aanwezigheid van hemoglobine worden geëvalueerd door spectrofotometer Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, VS) met behulp van de directe spectrofotometrische methode van Harboe met Allen-correctie: Hb (g / L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / verdunning in dH2O. De afkapwaarde voor serum is 0,020 g/l.

Voor de proteomische karakterisering van serum zal een nieuwe high-throughput omics-technologie worden gebruikt, gebaseerd op het SomaLogic SOMAscan-platform. Het systeem is gebaseerd op de detectie van SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamers), dit zijn aptamere vormen van DNA met hoge affiniteit en specificiteit voor het eiwitdoelwit. Bovendien zijn deze aptameren resistent tegen nucleotidase-activiteit en vertonen ze een hogere affiniteit dan normale antilichamen. Het panel dat in deze studie wordt gebruikt, stelt ons in staat om 1500 eiwitdoelen te evalueren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van metabole ziekten, die deel uitmaken van de algemene ontstekingsreactie en die van belang zijn voor de studie van hart- en vaatziekten en oncologie.

Over het algemeen zijn de gevoeligheid en prestaties van de test vergelijkbaar met die van een normale ELISA-kit, met limieten voor kwantificering rond 100 fM en detectie van 40 fM, en de noodzaak voor slechts 65 µL van het monster.

Validatie van kandidaten door ELISA: in deze fase zullen ten minste twee van de markers worden gevalideerd, geïdentificeerd in de ontdekkingsfase, die een significant verband hebben aangetoond met de toename van steatose in multi-parametrische correlatieanalyses. De validatie zal gebeuren door de kandidaten in de serummonsters te kwantificeren met behulp van specifieke commerciële ELISA-kits van het sandwichtype. Zoals vermeld in de vorige sectie, zullen er in totaal 52 monsters worden gemeten, waarvan 30 zijn ingeschreven voor de ontdekkingsfase (sera al opgeslagen) en nog eens 22 nieuwe monsters van proefpersonen die zijn ingeschreven voor de validatiefase.