Характеристика протеома сыворотки у субъектов с синдромом Прадера-Вилли (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Методы. Дизайн исследования. Исследование включает две фазы: первую исследовательскую фазу, известную как «открытие», в ходе которой 30 субъектов с синдромом Прадера-Вилли (СПВ) будут проанализированы с помощью технологии SOMAscan для получения протеомного профиля сыворотки. Стеатоз печени будет определяться с помощью УЗИ брюшной полости у пациентов с СПВ путем установления контрольной группы (степень стеатоза 0/1) и группы стеатоза (степень стеатоза 2/3). Впоследствии, по крайней мере, два биомаркера-кандидата будут отобраны и проверены с помощью ELISA в 30 образцах, использованных на этапе открытия (образцы уже присутствуют в нашем банке сывороток), и еще в 22 образцах от пациентов с СПВ, специально включенных в это исследование.

Пациенты:

Будут приняты во внимание 30 субъектов, уже набранных в нашем предыдущем проекте MIRNOMAPWS (RC-2018) с генетическим диагнозом СПВ, обоих полов и в возрасте от 18 до 45 лет в исходных условиях.

Для каждого пациента из медицинских карт будут собираться следующие переменные:

• антропометрические параметры (рост, вес, ИМТ, окружность талии);
• состав тела (безжировая масса, жировая масса) с использованием метода измерения импеданса (BIA);
• уровни стеатоза, измеренные с помощью ультразвука в соответствии со стандартными критериями
• основной метаболизм с помощью непрямой калориметрии;
• биохимические показатели, определяющие метаболический синдром (холестерин ЛПВП, триглицериды, сахар крови);
• артериальное давление;
• сопутствующая гормональная терапия (терапия гормоном роста, половые стероиды и/или L-тироксин).

Сбор сыворотки для протеомного анализа: протеомный анализ будет проводиться на 30 уже имеющихся образцах (используемых на этапе «обнаружения») и на 22 новых пациентах. Аналогично тому, что было сделано для проекта MIRNOMAPWS (RC-2018), образцы крови натощак у новых пациентов будут собираться путем стандартной венепункции в пробирки для разделения сыворотки BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, Великобритания) и центрифугироваться при 1900 g при 4°. C в течение 10 мин и при 16000 g при 4°C еще 10 мин. Супернатанты замораживали при -80°С для длительного хранения.

Протеомный анализ: перед протеомным анализом будет оцениваться наличие гемоглобина на спектрофотометре Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США) с использованием прямого спектрофотометрического метода Харбо с поправкой Аллена: Hb (г/л) = (167, 2 × А415 — 83,6 × А380 — 83,6 × А450) х 1/1000 х 1/разведение в dH2O. Пороговое значение, рассматриваемое для сыворотки, будет составлять 0,020 г/л.

Для протеомной характеристики сыворотки будет использоваться новая высокопроизводительная омиксная технология, основанная на платформе SomaLogic SOMAscan. Система основана на обнаружении SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamers), которые представляют собой аптамерные формы ДНК с высокой аффинностью и специфичностью в отношении белка-мишени. Кроме того, эти аптамеры устойчивы к нуклеотидазной активности и демонстрируют более высокую аффинность, чем нормальные антитела. Панель, используемая в этом исследовании, позволит нам оценить 1500 белков-мишеней, которые участвуют в развитии метаболических заболеваний, являются частью общей воспалительной реакции и представляют интерес для изучения сердечно-сосудистых заболеваний и онкологии.

В целом, чувствительность и производительность теста сравнимы с чувствительностью и эффективностью обычного набора ELISA, с ограничениями для количественного определения около 100 фМ и обнаружения 40 фМ, а также требуется всего 65 мкл образца.

Проверка кандидатов с помощью ELISA: на этом этапе будут проверены по крайней мере два маркера, идентифицированные на этапе открытия, которые продемонстрировали значительную связь с увеличением стеатоза в многопараметрическом корреляционном анализе. Валидация будет проводиться путем количественного определения кандидатов в образцах сыворотки с использованием специальных коммерческих наборов ELISA сэндвич-типа. Как упоминалось в предыдущем разделе, всего будет измерено 52 образца, 30 из которых зарегистрированы для этапа обнаружения (сыворотка уже сохранена) и еще 22 новых образца от субъектов, зарегистрированных для этапа проверки.