Charakterizace sérového proteomu u subjektů se syndromem Prader Willi (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Metody Návrh studie Studie zahrnuje dvě fáze, první průzkumnou fázi známou jako "objev", ve které bude 30 subjektů se syndromem Prader-Willi (PWS) analyzováno technologií SOMAscan za účelem provedení sérového proteomického profilu. Jaterní steatóza bude stanovena pomocí ultrazvuku břicha u jedinců s PWS stanovením kontrolní skupiny (stupeň steatózy 0/1) a skupiny steatotické (stupeň steatózy 2/3). Následně budou vybrány alespoň dva kandidátní biomarkery a ověřeny metodou ELISA ve 30 vzorcích použitých ve fázi objevování (vzorky již přítomné v naší sérové ​​bance) a dalších 22 vzorcích od pacientů s PWS konkrétně zařazených do této studie.

Pacienti:

Bude vzato v úvahu 30 subjektů již přijatých do našeho předchozího projektu MIRNOMAPWS (RC-2018) s genetickou diagnózou PWS, obou pohlaví a ve věku mezi 18 a 45 lety ve výchozím stavu.

Pro každého pacienta budou ze zdravotních záznamů shromážděny následující proměnné:

• antropometrické parametry (výška, váha, BMI, obvod pasu);
• složení těla (libová hmota, tuková hmota) pomocí techniky měření impedance (BIA);
• úrovně steatózy měřené ultrazvukem podle standardních kritérií
• základní metabolismus pomocí nepřímé kalorimetrie;
• biochemické parametry určující metabolický syndrom (HDL cholesterol, triglyceridy, krevní cukr);
• krevní tlak;
• souběžné hormonální terapie (terapie růstovým hormonem, pohlavní steroidy a/nebo l-tyroxin).

Odběr séra pro proteomickou analýzu: proteomická analýza bude provedena na 30 již dostupných vzorcích (použitých pro fázi „objevu“) a na 22 nových pacientech. Podobně jako v případě projektu MIRNOMAPWS (RC-2018) budou vzorky krve nalačno od nových pacientů odebírány standardní venepunkcí do sérových separačních zkumavek BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, UK) a centrifugovány při 1900 g při 4° C po dobu 10 minut a při 16 000 g při 4 °C po dobu dalších 10 minut. Supernatanty byly zmraženy při -80 °C pro dlouhodobé skladování.

Proteomická analýza: před proteomickou analýzou bude vyhodnocena přítomnost hemoglobinu spektrofotometrem Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) přímou spektrofotometrickou metodou Harboe s Allenovou korekcí: Hb (g / L) = (167, 2 x A415 - 83,6 x A380 - 83,6 x A450) x 1/1000 x 1 / ředění v dH20. Uvažovaná hranice pro sérum bude 0,020 g/l.

Pro proteomickou charakterizaci séra bude použita nová vysoce výkonná omická technologie založená na platformě SomaLogic SOMAscan. Systém je založen na detekci SOMAmerů (Slow Off-rate Modified Aptamer), což jsou aptamerní formy DNA s vysokou afinitou a specificitou pro proteinový cíl. Kromě toho jsou tyto aptamery odolné vůči nukleotidázové aktivitě a vykazují vyšší afinitu než normální protilátky. Panel použitý v této studii nám umožní vyhodnotit 1500 proteinových cílů, které se podílejí na rozvoji metabolických onemocnění, jsou součástí obecné zánětlivé reakce a jsou zajímavé pro studium kardiovaskulárních onemocnění a onkologie.

Obecně je citlivost a výkonnost testu srovnatelná s normální soupravou ELISA, s limity pro kvantifikaci kolem 100 fM a detekci 40 fM a potřebou pouze 65 µl vzorku.

Validace kandidátů pomocí ELISA: v této fázi budou validovány alespoň dva z markerů, identifikované ve fázi objevování, které prokázaly významnou souvislost se zvýšením steatózy v multiparametrických korelačních analýzách. Validace bude provedena kvantifikací kandidátů ve vzorcích séra pomocí specifických komerčních sad ELISA sendvičového typu. Jak již bylo zmíněno v předchozí části, bude měřeno celkem 52 vzorků, z nichž 30 je zařazeno do fáze objevu (séra již uložena) a dalších 22 nových vzorků od subjektů zařazených do fáze ověřování.