Caracterização do Proteoma Sérico em Indivíduos com Síndrome de Prader Willi (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Métodos Desenho do estudo O estudo inclui duas fases, uma primeira fase exploratória conhecida como "descoberta" na qual 30 indivíduos com Síndrome de Prader-Willi (PWS) serão analisados ​​com a tecnologia SOMAscan para realizar um perfil proteômico sérico. A esteatose hepática será determinada pelo uso de ultrassonografia abdominal em indivíduos SPW, estabelecendo o grupo controle (esteatose grau 0/1) e o esteatótico (esteatose grau 2/3). Posteriormente, pelo menos dois biomarcadores candidatos serão selecionados e validados por ELISA nas 30 amostras utilizadas na fase de descoberta (amostras já presentes em nosso banco de soro) e mais 22 amostras de pacientes SPW especificamente inscritos para este estudo.

Pacientes:

Serão considerados 30 indivíduos já recrutados em nosso projeto MIRNOMAPWS anterior (RC-2018) com diagnóstico genético de SPW, de ambos os sexos e com idade entre 18 e 45 anos em condições basais.

Para cada paciente, as seguintes variáveis ​​serão coletadas do prontuário:

• parâmetros antropométricos (altura, peso, IMC, circunferência da cintura);
• composição corporal (massa magra, massa gorda), utilizando a técnica de medição de impedância (BIA);
• níveis de esteatose medidos com ultrassom de acordo com critérios padrão
• metabolismo básico, usando calorimetria indireta;
• parâmetros bioquímicos determinantes da síndrome metabólica (colesterol HDL, triglicerídeos, glicemia);
• pressão arterial;
• terapias hormonais concomitantes (terapia com hormônio de crescimento, esteroides sexuais e/ou l-tiroxina).

Coleta de soro para análise proteômica: a análise proteômica será realizada nas 30 amostras já disponíveis (utilizadas para a fase de "descoberta") e em 22 novos pacientes. À semelhança do que foi feito para o projeto MIRNOMAPWS (RC-2018), amostras de sangue em jejum de novos pacientes serão coletadas por punção venosa padrão em tubos de separação de soro BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, Reino Unido) e centrifugadas a 1900g a 4° C por 10 minutos e a 16.000 g a 4°C por mais 10 minutos. Os sobrenadantes foram congelados a -80°C para armazenamento a longo prazo.

Análise proteômica: antes da análise proteômica será avaliada a presença de hemoglobina pelo espectrofotômetro Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) utilizando o método espectrofotométrico direto de Harboe com correção de Allen: Hb (g/L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / diluição em dH2O. O cut-off considerado para soro será de 0,020 g/L.

Para a caracterização proteômica do soro, será utilizada uma nova tecnologia ômica de alto rendimento baseada na plataforma SomaLogic SOMAscan. O sistema é baseado na detecção de SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptâmeros), que são formas aptaméricas de DNA com alta afinidade e especificidade para a proteína alvo. Além disso, esses aptâmeros são resistentes à atividade da nucleotidase e demonstram maior afinidade do que os anticorpos normais. O painel utilizado neste estudo permitirá avaliar 1500 alvos proteicos que estão envolvidos no desenvolvimento de doenças metabólicas, fazem parte da resposta inflamatória geral e são de interesse no estudo de doenças cardiovasculares e oncológicas.

Em geral, a sensibilidade e o desempenho do teste são comparáveis ​​aos de um kit ELISA normal, com limites de quantificação em torno de 100 fM e detecção de 40 fM, sendo necessários apenas 65 µL de amostra.

Validação de candidatos por ELISA: nesta fase serão validados pelo menos dois dos marcadores, identificados na fase de descoberta, que demonstraram associação significativa com o aumento da esteatose em análises multiparamétricas de correlação. A validação será feita pela quantificação dos candidatos nas amostras de soro utilizando kits específicos de ELISA comercial tipo sanduíche. Conforme mencionado na seção anterior, serão mensuradas um total de 52 amostras, sendo 30 inscritas para a fase de descoberta (soros já armazenados) e outras 22 novas amostras de sujeitos inscritos para a fase de validação.