Caracterización del proteoma sérico en sujetos con síndrome de Prader Willi (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Métodos Diseño del estudio El estudio consta de dos fases, una primera fase exploratoria conocida como "descubrimiento" en la que 30 sujetos con Síndrome de Prader-Willi (PWS) serán analizados con la tecnología SOMAscan para realizar un perfil proteómico sérico. La esteatosis hepática se determinará mediante el uso de ecografía abdominal en sujetos con SPW estableciendo el grupo control (esteatosis grado 0/1) y el esteatósico (esteatosis grado 2/3). Posteriormente, se seleccionarán y validarán por ELISA al menos dos biomarcadores candidatos en las 30 muestras utilizadas en la fase de descubrimiento (muestras ya presentes en nuestro banco de suero) y otras 22 muestras de pacientes con PWS inscritos específicamente para este estudio.

Pacientes:

Se tendrán en cuenta 30 sujetos ya reclutados en nuestro anterior proyecto MIRNOMAPWS (RC-2018) con diagnóstico genético de SPW, de ambos sexos y con edades comprendidas entre los 18 y los 45 años en condiciones basales.

Para cada paciente se recogerán de la historia clínica las siguientes variables:

• parámetros antropométricos (talla, peso, IMC, circunferencia de la cintura);
• composición corporal (masa magra, masa grasa), utilizando la técnica de medición de impedancia (BIA);
• niveles de esteatosis medidos con ultrasonido según criterios estándar
• metabolismo básico, mediante calorimetría indirecta;
• parámetros bioquímicos que determinan el síndrome metabólico (colesterol HDL, triglicéridos, azúcar en sangre);
• presión arterial;
• terapias hormonales concomitantes (terapia de hormona de crecimiento, esteroides sexuales y/o l-tiroxina).

Recogida de sueros para análisis proteómico: el análisis proteómico se realizará en las 30 muestras ya disponibles (utilizadas para la fase de "descubrimiento") y en 22 nuevos pacientes. De manera similar a lo que se hizo para el proyecto MIRNOMAPWS (RC-2018), se recolectarán muestras de sangre en ayunas de nuevos pacientes mediante punción venosa estándar en tubos de separación de suero BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, Reino Unido) y se centrifugarán a 1900 g a 4 ° C durante 10 min ya 16.000 g a 4°C durante 10 minutos más. Los sobrenadantes se congelaron a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.

Análisis proteómico: antes del análisis proteómico se evaluará la presencia de hemoglobina mediante espectrofotómetro Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.) utilizando el método espectrofotométrico directo de Harboe con corrección de Allen: Hb (g/L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / dilución en dH2O. El punto de corte considerado para suero será de 0,020 g/L.

Para la caracterización proteómica del suero, se utilizará una nueva tecnología ómica de alto rendimiento basada en la plataforma SomaLogic SOMAscan. El sistema se basa en la detección de SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamers), que son formas aptámeras de ADN con alta afinidad y especificidad por la proteína diana. Además, estos aptámeros son resistentes a la actividad de la nucleotidasa y muestran una mayor afinidad que los anticuerpos normales. El panel utilizado en este estudio nos permitirá evaluar 1500 dianas proteicas que están involucradas en el desarrollo de enfermedades metabólicas, forman parte de la respuesta inflamatoria general y son de interés en el estudio de enfermedades cardiovasculares y oncología.

En general, la sensibilidad y el rendimiento de la prueba son comparables a los de un kit ELISA normal, con límites de cuantificación alrededor de 100 fM y detección de 40 fM, y la necesidad de solo 65 µL de la muestra.

Validación de candidatos por ELISA: en esta fase se validarán al menos dos de los marcadores, identificados en la fase de descubrimiento, que hayan demostrado una asociación significativa con el aumento de la esteatosis en análisis de correlación multiparamétrica. La validación se realizará mediante la cuantificación de los candidatos en las muestras de suero mediante kits ELISA comerciales específicos tipo sándwich. Como se ha comentado en el apartado anterior, se medirán un total de 52 muestras, 30 de las cuales se inscribirán en la fase de descubrimiento (sueros ya almacenados) y otras 22 muestras nuevas de sujetos inscritos en la fase de validación.