Caractérisation du protéome sérique chez les sujets atteints du syndrome de Prader Willi (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Méthodologie Conception de l'étude L'étude comprend deux phases, une première phase exploratoire dite de « découverte » au cours de laquelle 30 sujets atteints du syndrome de Prader-Willi (SPW) seront analysés avec la technologie SOMAscan pour réaliser un profil protéomique sérique. La stéatose hépatique sera déterminée par l'utilisation de l'échographie abdominale chez les sujets PWS en établissant le groupe contrôle (stéatose grade 0/1) et celui stéatosique (stéatose grade 2/3). Par la suite, au moins deux biomarqueurs candidats seront sélectionnés et validés par ELISA dans les 30 échantillons utilisés dans la phase de découverte (échantillons déjà présents dans notre sérothèque) et 22 autres échantillons de patients PWS spécifiquement recrutés pour cette étude.

Les patients:

30 sujets déjà recrutés dans notre précédent projet MIRNOMAPWS (RC-2018) avec un diagnostic génétique de PWS, des deux sexes et âgés entre 18 et 45 ans dans les conditions de base, seront pris en considération.

Pour chaque patient, les variables suivantes seront collectées à partir des dossiers médicaux :

• paramètres anthropométriques (taille, poids, IMC, tour de taille) ;
• composition corporelle (masse maigre, masse grasse), en utilisant la technique de mesure d'impédance (BIA);
• niveaux de stéatose mesurés par échographie selon des critères standards
• métabolisme de base, utilisant la calorimétrie indirecte ;
• paramètres biochimiques déterminant le syndrome métabolique (cholestérol HDL, triglycérides, glycémie) ;
• pression artérielle;
• traitements hormonaux concomitants (hormonothérapie de croissance, stéroïdes sexuels et/ou l-thyroxine).

Prélèvement de sérum pour analyse protéomique : l'analyse protéomique sera réalisée sur les 30 échantillons déjà disponibles (utilisés pour la phase "découverte") et sur 22 nouveaux patients. De manière similaire à ce qui a été fait pour le projet MIRNOMAPWS (RC-2018), des échantillons de sang à jeun de nouveaux patients seront prélevés par ponction veineuse standard dans des tubes de séparation de sérum BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, UK) et centrifugés à 1900g à 4° C pendant 10 min et à 16 000 g à 4°C pendant 10 minutes supplémentaires. Les surnageants ont été congelés à -80°C pour un stockage à long terme.

Analyse protéomique : avant l'analyse protéomique la présence d'hémoglobine sera évaluée par le spectrophotomètre Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) en utilisant la méthode spectrophotométrique directe de Harboe avec correction Allen : Hb (g/L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / dilution en dH2O. Le seuil considéré pour le sérum sera de 0,020 g/L.

Pour la caractérisation protéomique du sérum, une nouvelle technologie omique à haut débit basée sur la plateforme SomaLogic SOMAscan sera utilisée. Le système est basé sur la détection des SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamers), qui sont des formes aptamériques d'ADN à haute affinité et spécificité pour la cible protéique. De plus, ces aptamères sont résistants à l'activité nucléotidase et présentent une affinité plus élevée que les anticorps normaux. Le panel utilisé dans cette étude permettra d'évaluer 1500 cibles protéiques impliquées dans le développement de maladies métaboliques, faisant partie de la réponse inflammatoire générale et présentant un intérêt pour l'étude des maladies cardiovasculaires et de l'oncologie.

En général, la sensibilité et les performances du test sont comparables à celles d'un kit ELISA normal, avec des limites de quantification autour de 100 fM et de détection de 40 fM, et le besoin de seulement 65 µL d'échantillon.

Validation des candidats par ELISA : dans cette phase, au moins deux des marqueurs seront validés, identifiés dans la phase de découverte, qui ont démontré une association significative avec l'augmentation de la stéatose dans les analyses de corrélation multi-paramétriques. La validation se fera en quantifiant les candidats dans les échantillons de sérum à l'aide de kits ELISA commerciaux spécifiques de type sandwich. Comme mentionné dans la section précédente, un total de 52 échantillons seront mesurés, dont 30 inscrits pour la phase de découverte (sérums déjà stockés) et 22 autres nouveaux échantillons provenant de sujets inscrits pour la phase de validation.