Charakterystyka proteomu surowicy u pacjentów z zespołem Pradera Williego (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Metody Projekt badania Badanie obejmuje dwie fazy, pierwszą fazę eksploracyjną znaną jako „odkrycie”, w której 30 pacjentów z zespołem Pradera-Williego (PWS) zostanie przeanalizowanych za pomocą technologii SOMAscan w celu wykonania profilu proteomicznego surowicy. Stłuszczenie wątroby zostanie określone za pomocą ultrasonografii jamy brzusznej u osób z PWS, ustalając grupę kontrolną (stopień stłuszczenia 0/1) i stłuszczoną (stopień stłuszczenia 2/3). Następnie co najmniej dwa kandydujące biomarkery zostaną wybrane i zatwierdzone za pomocą testu ELISA w 30 próbkach użytych w fazie odkrywania (próbki już obecne w naszym banku surowicy) oraz w kolejnych 22 próbkach od pacjentów z PWS specjalnie włączonych do tego badania.

Pacjenci:

Pod uwagę zostanie wziętych 30 osób już zrekrutowanych w naszym poprzednim projekcie MIRNOMAPWS (RC-2018) z genetyczną diagnozą PWS, obu płci iw wieku od 18 do 45 lat w warunkach wyjściowych.

Dla każdego pacjenta z dokumentacji medycznej zostaną zebrane następujące zmienne:

• parametry antropometryczne (wzrost, waga, BMI, obwód talii);
• skład ciała (masa beztłuszczowa, masa tkanki tłuszczowej) metodą pomiaru impedancji (BIA);
• poziomy stłuszczenia mierzone ultrasonograficznie według standardowych kryteriów
• podstawowa przemiana materii z wykorzystaniem kalorymetrii pośredniej;
• parametry biochemiczne warunkujące zespół metaboliczny (cholesterol HDL, trójglicerydy, cukier we krwi);
• ciśnienie krwi;
• jednocześnie stosowane terapie hormonalne (hormon wzrostu, sterydy płciowe i/lub l-tyroksyna).

Pobieranie surowicy do analizy proteomicznej: analiza proteomiczna zostanie przeprowadzona na 30 już dostępnych próbkach (wykorzystywanych w fazie „odkrywania”) i na 22 nowych pacjentach. Podobnie jak w przypadku projektu MIRNOMAPWS (RC-2018), próbki krwi na czczo od nowych pacjentów zostaną pobrane przez standardowe nakłucie żyły w probówkach do separacji surowicy BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, Wielka Brytania) i odwirowane przy 1900 g w temperaturze 4° C przez 10 minut i przy 16 000 g w 4°C przez kolejne 10 minut. Supernatanty zamrożono w temperaturze -80°C do długoterminowego przechowywania.

Analiza proteomiczna: przed analizą proteomiczną obecność hemoglobiny zostanie oceniona spektrofotometrem Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) metodą spektrofotometrii bezpośredniej Harboe z poprawką Allena: Hb (g/L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / rozcieńczenie w dH2O. Punkt odcięcia brany pod uwagę dla surowicy będzie wynosił 0,020 g/l.

Do charakterystyki proteomicznej surowicy zostanie wykorzystana nowa wysokowydajna technologia omiczna oparta na platformie SomaLogic SOMAscan. System opiera się na detekcji SOMAmerów (Slow Off-rate Modified Aptamer), które są aptamerycznymi formami DNA o wysokim powinowactwie i specyficzności względem docelowego białka. Ponadto aptamery te są oporne na aktywność nukleotydazy i wykazują wyższe powinowactwo niż normalne przeciwciała. Panel zastosowany w tym badaniu pozwoli nam ocenić 1500 celów białkowych, które biorą udział w rozwoju chorób metabolicznych, są częścią ogólnej odpowiedzi zapalnej i są interesujące w badaniach chorób układu krążenia i onkologii.

Ogólnie czułość i wydajność testu są porównywalne z normalnym zestawem ELISA, z limitami oznaczania ilościowego około 100 fM i wykrywalności 40 fM, przy czym potrzeba tylko 65 µl próbki.

Walidacja kandydatów za pomocą testu ELISA: w tej fazie zostaną zweryfikowane co najmniej dwa markery, zidentyfikowane w fazie odkrywania, które wykazały istotny związek ze wzrostem stłuszczenia w wieloparametrycznych analizach korelacji. Walidacja zostanie przeprowadzona poprzez oznaczenie ilościowe kandydatów w próbkach surowicy przy użyciu specjalnych komercyjnych zestawów ELISA typu kanapkowego. Jak wspomniano w poprzedniej części, zmierzone zostaną łącznie 52 próbki, z których 30 zostało zapisanych do fazy odkrywania (surowice już przechowywane), a kolejne 22 nowe próbki od pacjentów zapisanych do fazy walidacji.