Caratterizzazione del proteoma sierico in soggetti con sindrome di Prader Willi (PROTEOMARKER) (PROTEOMARKER)

Metodi Disegno dello studio Lo studio prevede due fasi, una prima fase esplorativa nota come "discovery" in cui 30 soggetti con Sindrome di Prader-Willi (PWS) verranno analizzati con la tecnologia SOMAscan per eseguire un profilo proteomico sierico. La steatosi epatica sarà determinata mediante l'uso dell'ecografia addominale nei soggetti con PWS stabilendo il gruppo di controllo (steatosi di grado 0/1) e quello steatotico (steatosi di grado 2/3). Successivamente, almeno due biomarcatori candidati saranno selezionati e validati da ELISA nei 30 campioni utilizzati nella fase di scoperta (campioni già presenti nella nostra banca del siero) e ulteriori 22 campioni di pazienti con PWS specificatamente arruolati per questo studio.

Pazienti:

Saranno presi in considerazione 30 soggetti già reclutati nel nostro precedente progetto MIRNOMAPWS (RC-2018) con diagnosi genetica di PWS, di entrambi i sessi e di età compresa tra 18 e 45 anni in condizioni basali.

Per ogni paziente verranno raccolte dalla cartella clinica le seguenti variabili:

• parametri antropometrici (altezza, peso, BMI, circonferenza vita);
• composizione corporea (massa magra, massa grassa), utilizzando la tecnica di misurazione dell'impedenza (BIA);
• livelli di steatosi misurati con ultrasuoni secondo criteri standard
• metabolismo di base, mediante calorimetria indiretta;
• parametri biochimici che determinano la sindrome metabolica (colesterolo HDL, trigliceridi, glicemia);
• pressione sanguigna;
• terapie ormonali concomitanti (terapia con ormone della crescita, steroidi sessuali e/o l-tiroxina).

Prelievo di siero per analisi proteomica: l'analisi proteomica sarà effettuata sui 30 campioni già disponibili (utilizzati per la fase di “discovery”) e su 22 nuovi pazienti. Analogamente a quanto fatto per il progetto MIRNOMAPWS (RC-2018), i campioni di sangue a digiuno da nuovi pazienti saranno raccolti mediante venopuntura standard in provette per la separazione del siero BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, UK) e centrifugati a 1900 g a 4° C per 10 min e a 16.000 g a 4°C per altri 10 minuti. I surnatanti sono stati congelati a -80°C per la conservazione a lungo termine.

Analisi proteomica: prima dell'analisi proteomica verrà valutata la presenza di emoglobina mediante spettrofotometro Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) utilizzando il metodo spettrofotometrico diretto di Harboe con correzione Allen: Hb (g/L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / diluizione in dH2O. Il cut-off considerato per il siero sarà di 0,020 g/L.

Per la caratterizzazione proteomica del siero verrà utilizzata una nuova tecnologia omica ad alto rendimento basata sulla piattaforma SomaLogic SOMAscan. Il sistema si basa sulla rilevazione di SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamers), che sono forme aptameriche di DNA con elevata affinità e specificità per la proteina target. Inoltre, questi aptameri sono resistenti all'attività nucleotidasica e dimostrano una maggiore affinità rispetto ai normali anticorpi. Il pannello utilizzato in questo studio ci consentirà di valutare 1500 bersagli proteici che sono coinvolti nello sviluppo di malattie metaboliche, fanno parte della risposta infiammatoria generale e sono di interesse per lo studio delle malattie cardiovascolari e dell'oncologia.

In generale, la sensibilità e le prestazioni del test sono paragonabili a quelle di un normale kit ELISA, con limiti di quantificazione intorno a 100 fM e rilevazione di 40 fM, e la necessità di soli 65 µL di campione.

Validazione dei candidati mediante ELISA: in questa fase verranno validati almeno due dei marcatori, individuati in fase di scoperta, che hanno dimostrato un'associazione significativa con l'aumento della steatosi nelle analisi di correlazione multiparametrica. La convalida verrà effettuata quantificando i candidati nei campioni di siero utilizzando specifici kit ELISA commerciali di tipo sandwich. Come accennato nella sezione precedente, verranno misurati complessivamente 52 campioni, di cui 30 arruolati per la fase di discovery (sieri già archiviati) e altri 22 nuovi campioni da soggetti arruolati per la fase di validazione.