Genomin laajuinen epistasis kardiovaskulaarisen vakavuuden vuoksi Marfan-tutkimuksessa (GEMS)

Tässä projektissa keskitymme Marfanin oireyhtymän kardiovaskulaariseen, tai tarkemmin sanottuna TAAD- (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) -ekspressiivisuuteen. Yleisin mutaatio FBN1:ssä (fibriliini-1), jolla on merkittävää aortopatian ilmentymistä, on p.Ile2585Thr; c.7754T>C ja p.Ala882Val; c.2645C>T). Rajoitamme käytetyn populaation arvoon p.Ile2585Thr; c.7754T>C-mutaatio, koska tämä on suurin populaatio.

Marfanin oireyhtymäpotilailla, joilla on identtinen FBN1-mutaatio, on vaihteleva aortopatian ilmentymä jopa yhden perheen sisällä. Oletamme, että kardiovaskulaarinen fenotyyppinen vaihtelu on geneettisten muuntajien hallinnassa.

Ensimmäisen lähestymistavan strategiaan kuuluu niiden spesifisen FBN1-mutaation kantajien luokittelu, joilla on merkittävää vaihtelevaa aortopatian ilmentymistä aortan aneurysmasairauden vakavuuden mukaan (perustuu Z-pisteeseen, leikkauksen ajoitukseen ja manuaaliseen asiantuntijakuraatioon). Jaotamme nämä mutaatiota kantavat yksilöt kolmeen ryhmään: lievä tai ei aorttasairaus (UMC, ei vaikuta mutaation kantaja)), vakavasti sairastunut (AMC, sairastunut mutaation kantaja) ja osallistujat, joilla on epämääräisiä tietoja.

Toinen lähestymistapa on 25 %:n äärimmäisen kohortin (AMC ja UMC) molekyylikarakterisointi käyttämällä WGS:ää (koko genomisekvenssi) ja kytkentäanalyysiä.

Lopuksi koehenkilöiden ääreisveren mononukleaarisolut (PBMC), joissa on 10 vakavasti sairastunutta mutaation kantajaa (AMC) ja 10 vahingoittumatonta mutaation kantajaa (UMC) sekä 2 kontrollia, ohjelmoidaan uudelleen iPSC:iksi (indusoidut pluripotentiaaliset kantasolut). Nämä solut erilaistuvat lopulta VSMC:iksi (VasculairSmoth Muscle Cells). iPSC:iden ja VSMC:iden genominen eheys ja identiteetti validoidaan käyttämällä RT-PCR:ää ja immunosytokemiaa.

Transkriptominen (ts. RNA-sekvensointitiedot saadaan näistä spesifisistä indusoiduista pluripotenteista kantasoluista johdetuista verisuonten sileälihassoluista (iPSC-VSMC:t).

Pystymme suodattamaan WGS-tiedot muunnelman laadun ja sijainnin perusteella geeneissä, jotka ilmentyvät eri tavalla, kun verrataan AMC- ja UMC-iPSC-VSMC:itä, molempien tietotyyppien synkronoinnin kautta. Tämä lähestymistapa antaa meille mahdollisuuden tunnistaa muuntajageeni. Kun ehdokasmuuntajageenit (ja siten ehdokasmuuntajavariantit) on tunnistettu, niiden modifiointikyky tarkistetaan toiminnallisesti asiaankuuluvissa solu- tai eläinmalleissa. Mallijärjestelmän valinta määräytyy tunnistetun modifioijan luonteen perusteella. Eläinmallissa todistamme sen vaikutuksen risteyttämällä kiinnostavaa varianttia kantavan eläimen MFS-mallin kanssa, jonka pitäisi muuttaa merkittävästi kardiovaskulaarista fenotyyppiä. Tunnistetun muuntajageenin toiminnasta ja evoluutionaarisesta säilymisestä riippuen käytetään seeprakala- tai hiirimalleja.

Vaihtoehtoisesti tunnistettu modifioija validoidaan toiminnallisesti käyttämällä huippuluokan CRISPR/Cas9 genomin muokkausteknologiaa saatavilla olevissa ja toiminnallisesti perusteellisesti karakterisoiduissa iPSC-VSMC-linjoissa.

Lisätodisteita mielenkiintoisimpien ehdokasgeenien muokkaavasta roolista saadaan suorittamalla kohdennettu uudelleensekvensointi näiden geenien koodaaville ja sääteleville sekvensseille jälleen 25 %:ssa eniten ja vähiten sydän- ja verisuonisairauksista kärsivissä MFS-tapauksissa suuressa replikaatiokohortissa, joka koostuu. yli 3000 kliinisesti ja molekulaarisesti (FBN1-mutaatiopositiivinen) karakterisoitu indeksitapaus.

Aina kun mahdollista, jäljellä olevien TAAD-suojattujen ehdokkaiden modifiointivarianttien erottelua tutkitaan saatavilla olevista gDNA-näytteistä koettimien FBN1-mutaation kantavista sukulaisista.