Epistasis de todo el genoma para la gravedad cardiovascular en el estudio de Marfan (GEMS)

En este proyecto nos centraremos en la expresividad cardiovascular, o más específicamente, la TAAD (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) del síndrome de Marfan. La mutación más frecuente en FBN1 (fibrilina-1), con importante expresividad de la aortopatía es p.Ile2585Thr; c.7754T>C y p.Ala882Val; c.2645C>T). Limitaremos la población utilizada a p.Ile2585Thr; c.7754T>C mutación ya que esta es la población más grande.

Los sujetos con síndrome de Marfan que portan una mutación FBN1 idéntica muestran una expresividad de la aortopatía variable, incluso dentro de una misma familia. Nuestra hipótesis es que la variabilidad fenotípica cardiovascular está bajo el control de modificadores genéticos.

La primera estrategia de enfoque implica clasificar a los portadores de la mutación FBN1 específica que presentan una expresividad de aortopatía variable significativa según la gravedad de la enfermedad del aneurisma aórtico (según la puntuación Z, el momento de la cirugía y la curación manual por expertos). Estratificaremos a estos individuos portadores de mutaciones en tres grupos: enfermedad aórtica leve o sin enfermedad (UMC, portador de mutación no afectado)), gravemente afectado (AMC, portador de mutación afectado) y participantes con datos indeterminados.

El segundo enfoque es la caracterización molecular de la cohorte extrema del 25% (AMC y UMC) mediante WGS (Secuenciación del genoma completo) y análisis de ligamiento.

Finalmente, los sujetos con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 10 portadores de mutaciones (AMC) gravemente afectados y 10 portadores de mutaciones no afectados (UMC), así como 2 controles, serán reprogramados a iPSC (células madre pluripotenciales inducidas). Estas células finalmente se diferenciarán en VSMC (células musculares VasculairSmoth). La integridad genómica y la identidad de las iPSC y las VSMC se validarán mediante RT-PCR e inmunocitoquímica.

Transcriptómica (es decir, Los datos de secuenciación de ARN) se adquirirán a partir de estas células del músculo liso vascular derivadas de células madre pluripotentes inducidas específicas (iPSC-VSMC).

Podremos filtrar los datos WGS en función de la calidad de la variante y la ubicación en genes que se expresan diferencialmente al comparar los iPSC-VSMC de AMC y UMC, mediante la sincronización de ambos tipos de datos. Este enfoque nos permitirá identificar el gen modificador. Una vez que se hayan identificado los genes modificadores candidatos (y, por tanto, las variantes modificadoras candidatas), su capacidad de modificación se comprobará funcionalmente en modelos celulares o animales relevantes. La elección del sistema modelo se determinará en función de la naturaleza del modificador identificado. En un modelo animal, probaremos su efecto cruzando un animal portador de la variante de interés con un modelo MFS, lo que debería alterar significativamente el fenotipo cardiovascular. Dependiendo de la función y conservación evolutiva del gen modificador identificado se utilizarán modelos de pez cebra o de ratón.

Alternativamente, el modificador identificado se validará funcionalmente utilizando la tecnología de edición del genoma CRISPR/Cas9 de vanguardia en las líneas iPSC-VSMC disponibles y completamente caracterizadas funcionalmente.

Se obtendrán más pruebas de un papel modificador de los genes candidatos más interesantes realizando una resecuenciación dirigida de las secuencias reguladoras y codificantes de estos genes en, nuevamente, el 25% de los casos de MFS con afectación cardiovascular más y menos grave de una gran cohorte de replicación compuesta por de más de 3000 casos índice caracterizados clínica y molecularmente (mutación FBN1 positiva).

Siempre que sea posible, se investigará la segregación de las variantes modificadoras candidatas restantes con protección contra TAAD en muestras de ADNg disponibles de los familiares de los probandos que portan la mutación FBN1.