Genomomfattende epistase for kardiovaskulær alvorlighet i Marfan-studien (GEMS)

I dette prosjektet vil vi fokusere på den kardiovaskulære, eller mer spesifikke, TAAD (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) ekspressiviteten til Marfan-syndromet. De hyppigste mutasjonene i FBN1 (fibrilin-1), med signifikant aortopatiekspressivitet er p.Ile2585Thr; c.7754T>C og p.Ala882Val; c.2645C>T). Vi vil begrense den brukte populasjonen til p.Ile2585Thr; c.7754T>C mutasjon siden dette er den største populasjonen.

Marfan-syndromindivider som bærer en identisk FBN1-mutasjon viser en variabel aortopatiekspressivitet, selv innenfor en familie. Vi antar at den kardiovaskulære fenotypiske variasjonen er under kontroll av genetiske modifikatorer.

Den første tilnærmingsstrategien involverer rangering av bærere av den spesifikke FBN1-mutasjonen som presenterer med signifikant variabel aortopatiekspressivitet i henhold til alvorlighetsgraden av aortaaneurismesykdom (basert på Z-score, timing for kirurgi og manuell ekspertkurering). Vi vil stratifisere disse mutasjonsbærende individene i tre grupper: mild eller ingen aortasykdom (UMC, upåvirket mutasjonsbærer)), alvorlig påvirket (AMC, affisert mutasjonsbærer) og deltakere med ubestemte data.

Den andre tilnærmingen er molekylær karakterisering av den 25% ekstreme kohorten (AMC og UMC) ved bruk av WGS (Whole Genome Sequencing) og koblingsanalyse.

Til slutt vil individer perifert blod mononukleære celler (PBMCs) av 10 alvorlig affiserte mutasjonsbærere (AMC) og 10 upåvirkede mutasjonsbærere (UMC) samt 2 kontroller omprogrammeres til iPSCs (induserte pluripotensielle stamceller). Disse cellene vil til slutt bli differensiert til VSMC-er (VasculairSmoth Muscle Cells). Den genomiske integriteten og identiteten til iPSC-ene og VSMC-ene vil bli validert ved hjelp av RT-PCR og immuncytokjemi.

Transkriptomisk (dvs. RNA-sekvensering) data vil bli innhentet fra disse spesifikke induserte pluripotente stamcelle-avledede vaskulære glatte muskelcellene (iPSC-VSMCs).

Vi vil være i stand til å filtrere WGS-dataene basert på variantkvalitet og plassering i gener som er differensielt uttrykt ved sammenligning av AMC og UMC iPSC-VSMC, via synkronisering av begge datatyper. Denne tilnærmingen vil tillate oss å identifisere modifiseringsgenet. Når kandidatmodifikatorgener (og dermed kandidatmodifikatorvarianter) er identifisert, vil deres modifiseringskapasitet bli funksjonelt sjekket i relevante celle- eller dyremodeller. Valget av modellsystemet vil bli bestemt basert på arten av den identifiserte modifikatoren. I en dyremodell vil vi bevise effekten ved å krysse et dyr som bærer varianten av interesse med en MFS-modell, som skulle endre den kardiovaskulære fenotypen betydelig. Avhengig av funksjon og evolusjonær bevaring av det identifiserte modifiseringsgenet, vil sebrafisk- eller musemodeller bli brukt.

Alternativt vil den identifiserte modifikatoren bli funksjonelt validert ved å bruke den banebrytende CRISPR/Cas9-genomredigeringsteknologien i de tilgjengelige og grundig funksjonelt karakteriserte iPSC-VSMC-linjene.

Ytterligere bevis for en modifiserende rolle til de mest interessante kandidatgenene vil bli oppnådd ved å utføre målrettet re-sekvensering av disse genenes kodende og regulatoriske sekvenser i, igjen, de 25 % mest og minst alvorlig kardiovaskulært påvirkede MFS-tilfellene av en stor replikasjonskohort som består av av mer enn 3000 klinisk og molekylært (FBN1 mutasjonspositive) karakteriserte indekstilfeller.

Når det er mulig, vil segregering av de gjenværende kandidatmodifikatorvariantene med beskyttelse mot TAAD bli undersøkt i tilgjengelige gDNA-prøver av probandenes slektninger som bærer FBN1-mutasjonen.