Epistasi dell'intero genoma per la gravità cardiovascolare nello studio Marfan (GEMS)

In questo progetto ci concentreremo sull'espressività cardiovascolare o, più specificatamente, sulla TAAD (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) della sindrome di Marfan. La mutazione più frequente in FBN1 (fibrillina-1), con significativa espressività aortopatica, è p.Ile2585Thr; c.7754T>C e p.Ala882Val; c.2645C>T). Limiteremo la popolazione utilizzata a p.Ile2585Thr; mutazione c.7754T>C poiché questa è la popolazione più numerosa.

I soggetti con sindrome di Marfan portatori di una mutazione identica in FBN1 mostrano un'espressività dell'aortopatia variabile, anche all'interno della stessa famiglia. Ipotizziamo che la variabilità fenotipica cardiovascolare sia sotto il controllo di modificatori genetici.

La prima strategia di approccio prevede la classificazione dei portatori della mutazione specifica FBN1 che presentano un'espressività dell'aortopatia variabile significativa in base alla gravità della malattia dell'aneurisma aortico (sulla base del punteggio Z, dei tempi dell'intervento chirurgico e della cura manuale da parte di esperti). Stratificazione questi individui portatori di mutazione in tre gruppi: malattia aortica lieve o assente (UMC, portatore di mutazione non affetto)), gravemente affetto (AMC, portatore di mutazione affetto) e partecipanti con dati indeterminati.

Il secondo approccio prevede la caratterizzazione molecolare della coorte estrema del 25% (AMC e UMC) mediante WGS (Whole Genome Sequencing) e analisi di linkage.

Infine, i soggetti cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) di 10 portatori di mutazione gravemente affetti (AMC) e 10 portatori di mutazione non affetti (UMC) nonché 2 controlli saranno riprogrammati in iPSC (cellule staminali pluripotenziali indotte). Queste cellule verranno infine differenziate in VSMC (VasculairSmoth Muscle Cells). L'integrità genomica e l'identità delle iPSC e delle VSMC saranno validate utilizzando RT-PCR e immunocitochimica.

Trascrittomica (es. I dati di sequenziamento dell'RNA) verranno acquisiti da queste specifiche cellule muscolari lisce vascolari pluripotenti indotte (iPSC-VSMC).

Saremo in grado di filtrare i dati WGS in base alla qualità delle varianti e alla posizione nei geni che sono espressi in modo differenziale quando si confrontano gli iPSC-VSMC AMC e UMC, tramite la sincronizzazione di entrambi i tipi di dati. Questo approccio ci permetterà di identificare il gene modificatore. Una volta identificati i geni modificatori candidati (e quindi le varianti modificatrici candidate), la loro capacità di modificazione sarà verificata funzionalmente in modelli cellulari o animali rilevanti. La scelta del sistema modello sarà determinata in base alla natura del modificatore identificato. In un modello animale, dimostreremo il suo effetto incrociando un animale portatore della variante di interesse con un modello MFS, che dovrebbe alterare significativamente il fenotipo cardiovascolare. A seconda della funzione e della conservazione evolutiva del gene modificatore identificato, verranno utilizzati modelli di pesce zebra o di topo.

In alternativa, il modificatore identificato sarà validato funzionalmente utilizzando la tecnologia all'avanguardia di editing genomico CRISPR/Cas9 nelle linee iPSC-VSMC disponibili e completamente caratterizzate dal punto di vista funzionale.

Ulteriori prove di un ruolo modificante dei geni candidati più interessanti saranno ottenute eseguendo un risequenziamento mirato delle sequenze codificanti e regolatrici di questi geni, ancora una volta, nel 25% dei casi di MFS affetti da malattie cardiovascolari più e meno gravemente di un'ampia coorte di replicazione composta da di oltre 3000 casi indice caratterizzati clinicamente e molecolare (positivi alla mutazione FBN1).

Quando possibile, verrà studiata la segregazione delle rimanenti varianti modificatrici candidate con protezione da TAAD nei campioni di gDNA disponibili dei parenti dei probandi portatori della mutazione FBN1.