Полногеномный эпистаз при тяжести сердечно-сосудистых заболеваний в исследовании Марфана (GEMS)

В этом проекте мы сосредоточимся на сердечно-сосудистой или, более конкретно, выраженности синдрома Марфана TAAD (расслоение аневризмы грудной аорты). Наиболее частыми мутациями в FBN1 (фибрилин-1) со значительной выраженностью аортопатии является p.Ile2585Thr; c.7754T>C и p.Ala882Val; ок.2645С>Т). Мы ограничим используемую популяцию до p.Ile2585Thr; Мутация c.7754T>C, поскольку это самая большая популяция.

Субъекты с синдромом Марфана, несущие идентичную мутацию FBN1, демонстрируют вариабельную выраженность аортопатии даже в пределах одной семьи. Мы предполагаем, что фенотипическая изменчивость сердечно-сосудистой системы находится под контролем генетических модификаторов.

Стратегия первого подхода включает ранжирование носителей специфической мутации FBN1, у которых наблюдается значительная вариабельная выраженность аортопатии, в зависимости от тяжести аневризмы аорты (на основе Z-показателя, времени хирургического вмешательства и ручного экспертного лечения). Мы разделим этих людей, несущих мутации, на три группы: легкая болезнь аорты или ее отсутствие (UMC, незатронутый носитель мутации)), тяжело пораженная (AMC, пораженный носитель мутации) и участники с неопределенными данными.

Второй подход заключается в молекулярной характеристике 25% крайней когорты (AMC и UMC) с использованием WGS (полного секвенирования генома) и анализа сцепления.

Наконец, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) 10 сильно пораженных носителей мутаций (AMC) и 10 незатронутых носителей мутаций (UMC), а также 2 контрольных человека будут перепрограммированы в ИПСК (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки). Эти клетки, наконец, будут дифференцированы в VSMC (мышечные клетки VasculairSmoth). Геномная целостность и идентичность ИПСК и СГМК будут проверены с помощью ОТ-ПЦР и иммуноцитохимии.

Транскриптомный (т. Данные секвенирования РНК) будут получены из этих специфически индуцированных плюрипотентных гладкомышечных клеток сосудов, полученных из стволовых клеток (iPSC-VSMC).

Мы сможем фильтровать данные WGS на основе качества вариантов и местоположения в генах, которые дифференциально экспрессируются при сравнении iPSC-VSMC AMC и UMC, посредством синхронизации обоих типов данных. Такой подход позволит нам идентифицировать ген-модификатор. Как только будут идентифицированы гены-кандидаты-модификаторы (и, следовательно, варианты-кандидаты-модификаторы), их модифицирующая способность будет функционально проверена на соответствующих клеточных или животных моделях. Выбор модельной системы будет определяться исходя из природы выявленного модификатора. На модели животных мы докажем его эффект, скрестив животное, несущее интересующий вариант, с моделью MFS, что должно значительно изменить сердечно-сосудистый фенотип. В зависимости от функции и эволюционной консервативности идентифицированного гена-модификатора будут использоваться модели рыбок данио или мышей.

Альтернативно, идентифицированный модификатор будет функционально проверен с использованием передовой технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 в доступных и тщательно охарактеризованных функционально линиях iPSC-VSMC.

Дополнительные доказательства модифицирующей роли наиболее интересных генов-кандидатов будут получены путем проведения целевого повторного секвенирования кодирующих и регуляторных последовательностей этих генов, опять же, в 25% случаев MFS с наиболее и наименее тяжелым сердечно-сосудистым поражением из большой репликационной группы, состоящей из из более чем 3000 клинически и молекулярно (положительных по мутации FBN1) охарактеризованных индексных случаев.

По возможности, сегрегация оставшихся вариантов-кандидатов-модификаторов с защитой от TAAD будет исследована в доступных образцах гДНК родственников пробандов, несущих мутацию FBN1.