Epistasia de todo o genoma para gravidade cardiovascular no estudo Marfan (GEMS)

Neste projeto focaremos na expressividade cardiovascular, ou mais especificamente, na expressividade TAAD (Dissecção de Aneurisma da Aorta Torácica) da síndrome de Marfan. As mutações mais frequentes no FBN1 (fibrilina-1), com expressividade significativa da aortopatia são p.Ile2585Thr; c.7754T>C e p.Ala882Val; c.2645C>T). Limitaremos a população utilizada a p.Ile2585Thr; Mutação c.7754T>C, uma vez que esta é a maior população.

Indivíduos com síndrome de Marfan portadores de uma mutação FBN1 idêntica apresentam expressividade de aortopatia variável, mesmo dentro de uma família. Nossa hipótese é que a variabilidade fenotípica cardiovascular está sob controle de modificadores genéticos.

A primeira estratégia de abordagem envolve a classificação dos portadores da mutação específica do FBN1 que apresentam expressividade significativa da aortopatia variável de acordo com a gravidade da doença do aneurisma da aorta (com base no escore Z, momento da cirurgia e curadoria manual especializada). Estratificaremos esses indivíduos portadores de mutação em três grupos: doença aórtica leve ou ausente (UMC, portador de mutação não afetado)), gravemente afetado (AMC, portador de mutação afetado) e participantes com dados indeterminados.

A segunda abordagem é a caracterização molecular da coorte extrema de 25% (AMC e UMC) usando WGS (Whole Genome Sequencing) e análise de ligação.

Finalmente, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de 10 portadores de mutação gravemente afetados (AMC) e 10 portadores de mutação não afetados (UMC), bem como 2 controles serão reprogramados para iPSCs (células-tronco pluripotenciais induzidas). Estas células serão finalmente diferenciadas em VSMC's (VasculairSmoth Muscle Cells). A integridade genômica e identidade das iPSCs e VSMCs serão validadas por RT-PCR e imunocitoquímica.

Transcriptômica (ou seja, Os dados de sequenciamento de RNA) serão adquiridos a partir dessas células musculares lisas vasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas específicas (iPSC-VSMCs).

Seremos capazes de filtrar os dados WGS com base na qualidade e localização das variantes em genes que são expressos diferencialmente ao comparar os iPSC-VSMCs AMC e UMC, através da sincronização de ambos os tipos de dados. Esta abordagem nos permitirá identificar o gene modificador. Uma vez identificados genes modificadores candidatos (e, portanto, variantes modificadoras candidatas), sua capacidade de modificação será verificada funcionalmente em modelos celulares ou animais relevantes. A escolha do sistema modelo será determinada com base na natureza do modificador identificado. Em modelo animal, comprovaremos seu efeito cruzando um animal portador da variante de interesse com um modelo MFS, o que deverá alterar significativamente o fenótipo cardiovascular. Dependendo da função e conservação evolutiva do gene modificador identificado, serão utilizados modelos de peixe-zebra ou camundongos.

Alternativamente, o modificador identificado será validado funcionalmente usando a tecnologia de ponta de edição de genoma CRISPR/Cas9 nas linhas iPSC-VSMC disponíveis e completamente caracterizadas funcionalmente.

Evidências adicionais de um papel modificador dos genes candidatos mais interessantes serão obtidas através da realização de re-sequenciamento direcionado das sequências codificadoras e reguladoras desses genes, novamente, nos 25% dos casos de MFS mais e menos gravemente afetados por doenças cardiovasculares de uma grande coorte de replicação consistindo de mais de 3.000 casos índice caracterizados clínica e molecularmente (positivos para mutação FBN1).

Sempre que possível, a segregação das restantes variantes modificadoras candidatas com proteção contra TAAD será investigada em amostras de gDNA disponíveis dos parentes dos probandos portadores da mutação FBN1.