Genomweite Epistase für den kardiovaskulären Schweregrad in der Marfan-Studie (GEMS)

In diesem Projekt konzentrieren wir uns auf die kardiovaskuläre, oder genauer gesagt, die TAAD-Ausprägung (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) des Marfan-Syndroms. Die häufigsten Mutationen in FBN1 (Fibrilin-1) mit signifikanter Aortopathie-Expressivität sind p.Ile2585Thr; c.7754T>C und p.Ala882Val; c.2645C>T). Wir werden die verwendete Population auf p.Ile2585Thr beschränken; c.7754T>C-Mutation, da dies die größte Population ist.

Patienten mit Marfan-Syndrom, die eine identische FBN1-Mutation tragen, zeigen eine variable Aortopathie-Ausprägung, sogar innerhalb einer Familie. Wir gehen davon aus, dass die kardiovaskuläre phänotypische Variabilität unter der Kontrolle genetischer Modifikatoren steht.

Die erste Ansatzstrategie umfasst die Einstufung von Trägern der spezifischen FBN1-Mutation, die eine signifikante variable Aortopathie-Expressivität aufweisen, entsprechend der Schwere der Aortenaneurysma-Erkrankung (basierend auf Z-Score, Zeitpunkt der Operation und manueller Expertenkuration). Wir werden diese mutationstragenden Personen in drei Gruppen einteilen: leichte oder keine Aortenerkrankung (UMC, nicht betroffener Mutationsträger)), schwer betroffen (AMC, betroffener Mutationsträger) und Teilnehmer mit unbestimmten Daten.

Der zweite Ansatz ist die molekulare Charakterisierung der 25 % extremen Kohorte (AMC und UMC) mittels WGS (Whole Genome Sequencing) und Verknüpfungsanalyse.

Schließlich werden den Probanden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von 10 stark betroffenen Mutationsträgern (AMC) und 10 nicht betroffenen Mutationsträgern (UMC) sowie 2 Kontrollen in iPSCs (induzierte pluripotente Stammzellen) umprogrammiert. Diese Zellen werden schließlich in VSMCs (VasculairSmoth Muscle Cells) differenziert. Die genomische Integrität und Identität der iPSCs und VSMCs werden mittels RT-PCR und Immunzytochemie validiert.

Transkriptom (d. h. RNA-Sequenzierungsdaten werden von diesen spezifischen induzierten pluripotenten, aus Stammzellen stammenden glatten Gefäßmuskelzellen (iPSC-VSMCs) erfasst.

Durch die Synchronisierung beider Datentypen werden wir in der Lage sein, die WGS-Daten anhand der Variantenqualität und -position in Genen zu filtern, die beim Vergleich der AMC- und UMC-iPSC-VSMCs unterschiedlich exprimiert werden. Dieser Ansatz wird es uns ermöglichen, das Modifikatorgen zu identifizieren. Sobald Kandidaten-Modifikatorgene (und damit Kandidaten-Modifikatorvarianten) identifiziert wurden, wird ihre modifizierende Fähigkeit in relevanten Zell- oder Tiermodellen funktionell überprüft. Die Wahl des Modellsystems wird auf der Grundlage der Art des identifizierten Modifikators bestimmt. In einem Tiermodell werden wir seine Wirkung beweisen, indem wir ein Tier, das die interessierende Variante trägt, mit einem MFS-Modell kreuzen, was den kardiovaskulären Phänotyp deutlich verändern sollte. Abhängig von der Funktion und der evolutionären Erhaltung des identifizierten Modifikatorgens werden Zebrafisch- oder Mausmodelle verwendet.

Alternativ wird der identifizierte Modifikator mithilfe der hochmodernen CRISPR/Cas9-Genomeditierungstechnologie in den verfügbaren und gründlich funktionell charakterisierten iPSC-VSMC-Linien funktionell validiert.

Weitere Beweise für eine modifizierende Rolle der interessantesten Kandidatengene werden durch eine gezielte Neusequenzierung der kodierenden und regulatorischen Sequenzen dieser Gene in wiederum den 25 % der am stärksten und am wenigsten stark kardiovaskulär betroffenen MFS-Fälle einer großen Replikationskohorte erhalten von mehr als 3000 klinisch und molekular (FBN1-Mutation-positiv) charakterisierten Indexfällen.

Wann immer möglich, wird die Trennung der verbleibenden möglichen Modifikatorvarianten mit Schutz vor TAAD in verfügbaren gDNA-Proben der Verwandten der Probanden untersucht, die die FBN1-Mutation tragen.