Genomomspændende epistase for kardiovaskulær sværhedsgrad i Marfan-undersøgelse (GEMS)

I dette projekt vil vi fokusere på den kardiovaskulære eller mere specifikke TAAD (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) ekspressivitet af Marfan syndromet. De hyppigste mutationer i FBN1 (fibrilin-1), med signifikant aortopati ekspressivitet er p.Ile2585Thr; c.7754T>C og p.Ala882Val; c.2645C>T). Vi vil begrænse den brugte population til p.Ile2585Thr; c.7754T>C mutation, da dette er den største population.

Marfan syndrom personer, der bærer en identisk FBN1 mutation, viser en variabel aortopati ekspressivitet, selv inden for en familie. Vi antager, at den kardiovaskulære fænotypiske variabilitet er under kontrol af genetiske modifikatorer.

Den første tilgangsstrategi involverer rangering af bærere af den specifikke FBN1-mutation, der viser sig med signifikant variabel aortopatiekspression i henhold til sværhedsgraden af ​​aortaaneurismesygdom (baseret på Z-score, timing af operation og manuel ekspertkuration). Vi vil stratificere disse mutationsbærende individer i tre grupper: mild eller ingen aortasygdom (UMC, upåvirket mutationsbærer)), alvorligt påvirket (AMC, påvirket mutationsbærer) og deltagere med ubestemte data.

Den anden tilgang er den molekylære karakterisering af den 25% ekstreme kohorte (AMC og UMC) ved hjælp af WGS (Whole Genome Sequencing) og koblingsanalyse.

Endelig vil forsøgspersoners perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) af 10 alvorligt påvirkede mutationsbærere (AMC) og 10 upåvirkede mutationsbærere (UMC) samt 2 kontroller blive omprogrammeret til iPSC'er (inducerede pluripotentielle stamceller). Disse celler vil endelig blive differentieret til VSMC'er (VasculairSmoth Muscle Cells). Den genomiske integritet og identitet af iPSC'erne og VSMC'erne vil blive valideret ved hjælp af RT-PCR og immuncytokemi.

Transkriptomisk (dvs. RNA-sekventering) data vil blive erhvervet fra disse specifikke inducerede pluripotente stamcelle-afledte vaskulære glatte muskelceller (iPSC-VSMC'er).

Vi vil være i stand til at filtrere WGS-dataene baseret på variantkvalitet og placering i gener, der udtrykkes differentielt, når man sammenligner AMC og UMC iPSC-VSMC'erne, via synkronisering af begge datatyper. Denne tilgang vil give os mulighed for at identificere modificeringsgenet. Når kandidatmodificerende gener (og dermed kandidatmodificerende varianter) er blevet identificeret, vil deres modificerende kapacitet blive funktionelt kontrolleret i relevante celle- eller dyremodeller. Valget af modelsystemet vil blive bestemt baseret på arten af ​​den identificerede modifikator. I en dyremodel vil vi bevise dens effekt ved at krydse et dyr, der bærer varianten af ​​interesse, med en MFS-model, som væsentligt skulle ændre den kardiovaskulære fænotype. Afhængigt af funktionen og den evolutionære konservering af det identificerede modificerende gen, vil zebrafisk- eller musemodeller blive brugt.

Alternativt vil den identificerede modifikator blive funktionelt valideret ved hjælp af den banebrydende CRISPR/Cas9-genomredigeringsteknologi i de tilgængelige og grundigt funktionelt karakteriserede iPSC-VSMC-linjer.

Yderligere beviser for en modificerende rolle af de mest interessante kandidatgener vil blive opnået ved at udføre målrettet re-sekventering af disse geners kodende og regulatoriske sekvenser i, igen, de 25 % mest og mindst alvorligt kardiovaskulært påvirkede MFS-tilfælde af en stor replikationskohorte bestående af af mere end 3000 klinisk og molekylært (FBN1 mutationspositive) karakteriserede indekstilfælde.

Når det er muligt, vil adskillelse af de resterende kandidatmodifikatorvarianter med beskyttelse mod TAAD blive undersøgt i tilgængelige gDNA-prøver af probandernes slægtninge, der bærer FBN1-mutationen.