Epistaza obejmująca cały genom w przypadku ciężkości układu sercowo-naczyniowego w badaniu Marfana (GEMS)

W tym projekcie skupimy się na układzie sercowo-naczyniowym, a dokładniej na ekspresji TAAD (rozwarstwienie tętniaka aorty piersiowej) w zespole Marfana. Najczęstsze mutacje w FBN1 (fibrylina-1), charakteryzujące się znaczną ekspresją w aortopatii, to p.Ile2585Thr; c.7754T>C i p.Ala882Val; ok. 2645C>T). Ograniczymy używaną populację do p.Ile2585Thr; mutacja c.7754T>C, ponieważ jest to największa populacja.

Osoby z zespołem Marfana posiadające identyczną mutację FBN1 wykazują zmienną ekspresję aortopatii, nawet w obrębie jednej rodziny. Stawiamy hipotezę, że zmienność fenotypowa układu sercowo-naczyniowego jest pod kontrolą modyfikatorów genetycznych.

Strategia pierwszego podejścia obejmuje ranking nosicieli specyficznej mutacji FBN1, u których występuje istotna zmienna ekspresja aortopatii w zależności od ciężkości choroby tętniaka aorty (w oparciu o Z-score, czas operacji i ręczne leczenie przez eksperta). Podzielimy te osoby niosące mutację na trzy grupy: łagodna choroba aorty lub brak choroby (UMC, nienaruszony nosiciel mutacji)), poważnie dotknięta (AMC, dotknięty nosiciel mutacji) oraz uczestnicy z nieokreślonymi danymi.

Drugie podejście polega na charakterystyce molekularnej 25% skrajnej kohorty (AMC i UMC) przy użyciu WGS (sekwencjonowanie całego genomu) i analizy powiązań.

Na koniec komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) 10 poważnie dotkniętych nosicieli mutacji (AMC) i 10 nienaruszonych nosicieli mutacji (UMC), a także 2 kontrole zostaną przeprogramowane na iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste). Komórki te zostaną ostatecznie zróżnicowane w VSMC (komórki mięśniowe VasculairSmoth). Integralność genomu i tożsamość iPSC i VSMC zostaną zweryfikowane za pomocą RT-PCR i immunocytochemii.

Transkryptomiczne (tj. Dane dotyczące sekwencjonowania RNA) zostaną uzyskane z tych specyficznych, indukowanych pluripotencjalnych komórek mięśni gładkich naczyń pochodzących z komórek macierzystych (iPSC-VSMC).

Będziemy mogli filtrować dane WGS w oparciu o jakość i lokalizację wariantów w genach, które ulegają różnej ekspresji podczas porównywania komórek iPSC-VSMC AMC i UMC, poprzez synchronizację obu typów danych. Takie podejście pozwoli nam zidentyfikować gen modyfikujący. Po zidentyfikowaniu potencjalnych genów modyfikujących (a tym samym potencjalnych wariantów modyfikatorów), ich zdolność do modyfikacji zostanie funkcjonalnie sprawdzona w odpowiednich modelach komórkowych lub zwierzęcych. Wybór układu modelowego zostanie określony na podstawie charakteru zidentyfikowanego modyfikatora. Na modelu zwierzęcym udowodnimy jego działanie, krzyżując zwierzę niosące interesujący nas wariant z modelem MFS, co powinno znacząco zmienić fenotyp układu sercowo-naczyniowego. W zależności od funkcji i ewolucyjnej ochrony zidentyfikowanego genu modyfikującego, zastosowane zostaną modele danio pręgowanego lub myszy.

Alternatywnie zidentyfikowany modyfikator zostanie zweryfikowany funkcjonalnie przy użyciu najnowocześniejszej technologii edycji genomu CRISPR/Cas9 w dostępnych i dokładnie scharakteryzowanych funkcjonalnie liniach iPSC-VSMC.

Dalsze dowody na modyfikującą rolę najciekawszych genów kandydujących zostaną uzyskane poprzez przeprowadzenie ukierunkowanego ponownego sekwencjonowania sekwencji kodujących i regulacyjnych tych genów w 25% przypadków MFS z najbardziej i najmniej poważnie dotkniętym układem sercowo-naczyniowym w dużej kohorcie replikacyjnej obejmującej z ponad 3000 przypadków indeksowych scharakteryzowanych klinicznie i molekularnie (pozytywna mutacja FBN1).

O ile to możliwe, segregacja pozostałych kandydujących wariantów modyfikatorów z ochroną przed TAAD zostanie zbadana w dostępnych próbkach gDNA krewnych probantów niosących mutację FBN1.