Genomomfattande epistas för kardiovaskulär svårighetsgrad i Marfan-studien (GEMS)

I detta projekt kommer vi att fokusera på den kardiovaskulära, eller mer specifik, TAAD (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) uttrycksförmåga av Marfans syndrom. De vanligaste mutationerna i FBN1 (fibrilin-1 ), med signifikant aortopati-expressivitet är p.Ile2585Thr; c.7754T>C och p.Ala882Val; c.2645C>T). Vi kommer att begränsa den använda populationen till p.Ile2585Thr; c.7754T>C mutation eftersom detta är den största populationen.

Marfans syndrompatienter som bär en identisk FBN1-mutation uppvisar en varierande uttrycksförmåga för aortopati, även inom en familj. Vi antar att den kardiovaskulära fenotypiska variationen är under kontroll av genetiska modifierare.

Den första strategin involverar rangordning av bärare av den specifika FBN1-mutationen som uppvisar signifikant variabel aortopatiuttrycksförmåga enligt svårighetsgraden av aortaaneurysmsjukdom (baserat på Z-poäng, tidpunkt för operation och manuell expertkuration). Vi kommer att stratifiera dessa mutationsbärande individer i tre grupper: mild eller ingen aortasjukdom (UMC, opåverkad mutationsbärare)), allvarligt påverkade (AMC, påverkad mutationsbärare) och deltagare med obestämda data.

Det andra tillvägagångssättet är den molekylära karakteriseringen av den 25% extrema kohorten (AMC och UMC) med hjälp av WGS (Whole Genome Sequencing) och länkanalys.

Slutligen kommer försökspersonerna perifera mononukleära blodceller (PBMC) av 10 allvarligt påverkade mutationsbärare (AMC) och 10 opåverkade mutationsbärare (UMC) samt 2 kontroller att omprogrammeras till iPSCs (inducerade pluripotentiella stamceller). Dessa celler kommer slutligen att differentieras till VSMC:s (VasculairSmoth Muscle Cells). Den genomiska integriteten och identiteten för iPSC och VSMC kommer att valideras med RT-PCR och immuncytokemi.

Transkriptomisk (dvs. RNA-sekvensering) data kommer att erhållas från dessa specifika inducerade pluripotenta stamcellshärledda vaskulära glatta muskelceller (iPSC-VSMCs).

Vi kommer att kunna filtrera WGS-data baserat på variantkvalitet och placering i gener som uttrycks differentiellt när man jämför AMC och UMC iPSC-VSMC, via synkronisering av båda datatyperna. Detta tillvägagångssätt kommer att tillåta oss att identifiera modifieringsgenen. När kandidatmodifieringsgener (och därmed kandidatmodifieringsvarianter) har identifierats, kommer deras modifierande kapacitet att kontrolleras funktionellt i relevanta cell- eller djurmodeller. Valet av modellsystem kommer att bestämmas baserat på arten av den identifierade modifieraren. I en djurmodell kommer vi att bevisa dess effekt genom att korsa ett djur som bär varianten av intresse med en MFS-modell, vilket avsevärt borde förändra den kardiovaskulära fenotypen. Beroende på funktionen och evolutionär bevarande av den identifierade modifieringsgenen kommer zebrafisk- eller musmodeller att användas.

Alternativt kommer den identifierade modifieraren att valideras funktionellt med den banbrytande CRISPR/Cas9-genomredigeringsteknologin i de tillgängliga och noggrant funktionellt karakteriserade iPSC-VSMC-linjerna.

Ytterligare bevis för en modifierande roll för de mest intressanta kandidatgenerna kommer att erhållas genom att utföra målinriktad omsekvensering av dessa geners kodande och regulatoriska sekvenser i, återigen, de 25 % mest och minst allvarligt kardiovaskulärt påverkade MFS-fallen av en stor replikationskohort bestående av av mer än 3000 kliniskt och molekylärt (FBN1 mutationspositiva) karakteriserade indexfall.

Närhelst det är möjligt kommer segregering av de återstående modifierande kandidatvarianterna med skydd från TAAD att undersökas i tillgängliga gDNA-prover av probands släktingar som bär på FBN1-mutationen.