Genoombrede epistasis voor cardiovasculaire ernst in Marfan-onderzoek (GEMS)

In dit project zullen we ons concentreren op de cardiovasculaire, of meer specifiek, de TAAD (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) expressiviteit van het Marfan syndroom. De meest voorkomende mutaties in FBN1 (fibrilin-1), met significante aortopathie-expressiviteit, is p.Ile2585Thr; c.7754T>C en p.Ala882Val; c.2645C>T). We zullen de gebruikte populatie beperken tot p.Ile2585Thr; c.7754T>C-mutatie aangezien dit de grootste populatie is.

Patiënten met het Marfansyndroom die een identieke FBN1-mutatie dragen, vertonen een variabele aortopathie-expressiviteit, zelfs binnen één familie. Onze hypothese is dat de cardiovasculaire fenotypische variabiliteit onder controle staat van genetische modificatoren.

De eerste benaderingsstrategie omvat het rangschikken van dragers van de specifieke FBN1-mutatie die een significante variabele aortopathie-expressiviteit vertonen op basis van de ernst van de aorta-aneurysmaziekte (gebaseerd op Z-score, timing van de operatie en manuele curatie door deskundigen). We zullen deze mutatiedragende individuen in drie groepen indelen: milde of geen aortaziekte (UMC, niet-aangetaste mutatiedrager)), ernstig getroffen (AMC, aangetaste mutatiedrager) en deelnemers met onbepaalde gegevens.

De tweede benadering is de moleculaire karakterisering van het 25% extreme cohort (AMC en UMC) met behulp van WGS (Whole Genome Sequencing) en koppelingsanalyse.

Ten slotte zullen proefpersonen mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC's) van 10 ernstig aangetaste mutatiedragers (AMC) en 10 niet-aangetaste mutatiedragers (UMC) en 2 controles worden geherprogrammeerd naar iPSC's (geïnduceerde pluripotentiële stamcellen). Deze cellen zullen uiteindelijk worden gedifferentieerd tot VSMC's (VasculairSmoth Muscle Cells). De genomische integriteit en identiteit van de iPSCs en de VSMCs zullen gevalideerd worden met behulp van RT-PCR en immunocytochemie.

Transcriptomisch (d.w.z. RNA-sequencing) gegevens zullen worden verkregen uit deze specifiek geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide vasculaire gladde spiercellen (iPSC-VSMCs).

We zullen de WGS-gegevens kunnen filteren op basis van variantkwaliteit en locatie in genen die differentieel tot expressie komen bij het vergelijken van de AMC- en UMC iPSC-VSMC's, via de synchronisatie van beide gegevenstypen. Deze aanpak zal ons in staat stellen het modificerende gen te identificeren. Zodra kandidaat-modificerende genen (en dus kandidaat-modificerende varianten) zijn geïdentificeerd, zal hun modificerend vermogen functioneel worden gecontroleerd in relevante cel- of diermodellen. De keuze van het modelsysteem zal worden bepaald op basis van de aard van de geïdentificeerde modifier. In een diermodel zullen we het effect ervan bewijzen door een dier dat de gewenste variant draagt, te kruisen met een MFS-model, dat het cardiovasculaire fenotype aanzienlijk zou moeten veranderen. Afhankelijk van de functie en de evolutionaire conservering van het geïdentificeerde modificerende gen zullen zebravis- of muismodellen worden gebruikt.

Als alternatief zal de geïdentificeerde modifier functioneel gevalideerd worden met behulp van de geavanceerde CRISPR/Cas9-technologie voor genoombewerking in de beschikbare en grondig functioneel gekarakteriseerde iPSC-VSMC-lijnen.

Verder bewijs voor een modificerende rol van de meest interessante kandidaat-genen zal worden verkregen door het uitvoeren van gerichte hersequencing van de coderende en regulerende sequenties van deze genen in, wederom, de 25% meest en minst ernstig cardiovasculair getroffen MFS-gevallen van een groot replicatiecohort bestaande uit van meer dan 3000 klinisch en moleculair (FBN1-mutatiepositieve) gekarakteriseerde indexgevallen.

Waar mogelijk zal de segregatie van de resterende kandidaat-modificatorvarianten met bescherming tegen TAAD worden onderzocht in beschikbare gDNA-monsters van de familieleden van de probands die de FBN1-mutatie dragen.