Genomová epistáza kardiovaskulární závažnosti v Marfanově studii (GEMS)

V tomto projektu se zaměříme na kardiovaskulární, přesněji řečeno, TAAD (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) expresivitu Marfanova syndromu. Nejčastější mutace ve FBN1 (fibrilin-1 ) s významnou aortopatií expresí je p.Ile2585Thr; c.7754T>C a p.Ala882Val; c.2645C>T). Omezíme použitou populaci na p.Ile2585Thr; c.7754T>C mutace, protože se jedná o největší populaci.

Subjekty s Marfanovým syndromem nesoucí identickou mutaci FBN1 vykazují různou expresi aortopatie, a to i v rámci jedné rodiny. Předpokládáme, že kardiovaskulární fenotypová variabilita je pod kontrolou genetických modifikátorů.

Strategie prvního přístupu zahrnuje klasifikaci přenašečů specifické mutace FBN1, kteří vykazují signifikantně variabilní expresivitu aortopatie podle závažnosti onemocnění aneuryzmatu aorty (na základě Z-skóre, načasování operace a manuální odborné kurace). Budeme stratifikovat tyto jedince nesoucí mutaci do tří skupin: mírné nebo žádné onemocnění aorty (UMC, nepostižený nosič mutace)), těžce postižené (AMC, postižený nosič mutace) a účastníci s neurčitými údaji.

Druhým přístupem je molekulární charakterizace 25% extrémní kohorty (AMC a UMC) pomocí WGS (Whole Genome Sequencing) a vazebné analýzy.

Nakonec budou subjekty periferní krve mononukleární buňky (PBMC) z 10 vážně postižených přenašečů mutace (AMC) a 10 přenašečů nepostižených mutací (UMC), stejně jako 2 kontroly přeprogramovány na iPSC (indukované pluripotenciální kmenové buňky). Tyto buňky budou nakonec diferencovány na VSMC's (VasculairSmoth Muscle Cells). Genomická integrita a identita iPSC a VSMC budou ověřeny pomocí RT-PCR a imunocytochemie.

Transkriptomické (tj. RNA-sekvenování) data budou získána z těchto specifických indukovaných pluripotentních buněk vaskulárního hladkého svalstva odvozených z kmenových buněk (iPSC-VSMC).

Budeme schopni filtrovat data WGS na základě kvality variant a umístění v genech, které jsou rozdílně vyjádřeny při srovnání AMC a UMC iPSC-VSMC, prostřednictvím synchronizace obou typů dat. Tento přístup nám umožní identifikovat modifikační gen. Jakmile byly identifikovány kandidátní modifikační geny (a tedy kandidátní modifikační varianty), bude jejich modifikační kapacita funkčně zkontrolována v příslušných buněčných nebo zvířecích modelech. Volba modelového systému bude určena na základě povahy identifikovaného modifikátoru. Na zvířecím modelu prokážeme jeho účinek křížením zvířete nesoucího zájmovou variantu s modelem MFS, který by měl významně změnit kardiovaskulární fenotyp. V závislosti na funkci a evoluční konzervaci identifikovaného modifikačního genu budou použity modely zebřičky nebo myši.

Alternativně bude identifikovaný modifikátor funkčně ověřen pomocí špičkové technologie úpravy genomu CRISPR/Cas9 v dostupných a důkladně funkčně charakterizovaných liniích iPSC-VSMC.

Další důkazy pro modifikující roli nejzajímavějších kandidátních genů budou získány provedením cíleného opětovného sekvenování kódujících a regulačních sekvencí těchto genů, opět u 25 % nejvíce a nejméně vážně kardiovaskulárně postižených MFS případů velké replikační kohorty sestávající z více než 3000 klinicky a molekulárně (pozitivní mutace FBN1) charakterizovaných indexových případů.

Kdykoli to bude možné, segregace zbývajících kandidátních variant modifikátoru s ochranou před TAAD bude zkoumána v dostupných vzorcích gDNA příbuzných probandů nesoucích mutaci FBN1.