Épistase à l'échelle du génome pour la gravité cardiovasculaire dans l'étude Marfan (GEMS)

Dans ce projet, nous nous concentrerons sur l'expressivité cardiovasculaire, ou plus spécifiquement, la TAAD (Thoracal Aorta Aneurysma Dissection) du syndrome de Marfan. La mutation la plus fréquente de FBN1 (fibriline-1), avec une expressivité significative de l'aortopathie, est p.Ile2585Thr ; c.7754T>C et p.Ala882Val ; c.2645C>T). Nous limiterons la population utilisée à p.Ile2585Thr ; mutation c.7754T>C puisqu’il s’agit de la plus grande population.

Les sujets atteints du syndrome de Marfan porteurs d'une mutation FBN1 identique présentent une expressivité aortopathie variable, même au sein d'une même famille. Nous émettons l'hypothèse que la variabilité phénotypique cardiovasculaire est sous le contrôle de modificateurs génétiques.

La première stratégie d'approche consiste à classer les porteurs de la mutation spécifique FBN1 qui présentent une expressivité variable significative de l'aortopathie en fonction de la gravité de l'anévrisme aortique (sur la base du score Z, du moment de la chirurgie et de la curation manuelle par un expert). Nous stratifierons ces individus porteurs de mutations en trois groupes : maladie aortique légère ou inexistante (UMC, porteur de mutation non affecté)), gravement touchée (AMC, porteur de mutation affecté) et participants avec des données indéterminées.

La deuxième approche est la caractérisation moléculaire de la cohorte extrême de 25 % (AMC et UMC) à l'aide du WGS (Whole Genome Sequencing) et de l'analyse de liaison.

Enfin, les sujets sont des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de 10 porteurs de mutation sévèrement affectés (AMC) et 10 porteurs de mutation non affectés (UMC) ainsi que 2 contrôles seront reprogrammés en iPSC (cellules souches pluripotentes induites). Ces cellules seront finalement différenciées en CMLV (VasculairSmoth Muscle Cells). L'intégrité génomique et l'identité des iPSC et des CMLV seront validées par RT-PCR et immunocytochimie.

Transcriptomique (c'est-à-dire Les données de séquençage d'ARN) seront acquises à partir de ces cellules musculaires lisses vasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites spécifiques (iPSC-VSMC).

Nous serons en mesure de filtrer les données WGS en fonction de la qualité et de l'emplacement des variantes dans les gènes qui sont exprimés de manière différentielle lors de la comparaison des iPSC-VSMC AMC et UMC, via la synchronisation des deux types de données. Cette approche nous permettra d'identifier le gène modificateur. Une fois que les gènes modificateurs candidats (et donc les variantes modificatrices candidates) ont été identifiés, leur capacité de modification sera vérifiée fonctionnellement dans des modèles cellulaires ou animaux pertinents. Le choix du système modèle sera déterminé en fonction de la nature du modificateur identifié. Dans un modèle animal, nous prouverons son effet en croisant un animal porteur du variant d'intérêt avec un modèle MFS, ce qui devrait altérer significativement le phénotype cardiovasculaire. En fonction de la fonction et de la conservation évolutive du gène modificateur identifié, des modèles de poisson zèbre ou de souris seront utilisés.

Alternativement, le modificateur identifié sera fonctionnellement validé à l'aide de la technologie de pointe d'édition du génome CRISPR/Cas9 dans les lignées iPSC-VSMC disponibles et fonctionnellement caractérisées.

Des preuves supplémentaires d'un rôle modificateur des gènes candidats les plus intéressants seront obtenues en effectuant un re-séquençage ciblé des séquences codantes et régulatrices de ces gènes dans, encore une fois, les 25 % des cas de MFS les plus et les moins gravement atteints de maladies cardiovasculaires d'une grande cohorte de réplication composée de plus de 3 000 cas index caractérisés cliniquement et moléculairement (mutation FBN1 positive).

Dans la mesure du possible, la ségrégation des variantes modificatrices candidates restantes avec protection contre TAAD sera étudiée dans les échantillons d'ADNg disponibles des parents des proposants porteurs de la mutation FBN1.