Polymerase Chain Reaction (PCR):n käyttöönotto mikrobiologiassa ja parasitologiassa

Tutkimuksemme on havainnollinen retrospektiivinen ja prospektiivinen poikkileikkausdiagnostiikan pilottitutkimus, joka vertailee standardeja rutiinilaboratoriotestejä ja uusia molekyylibiologisia testejä. Erityisesti havaitsisimme pääasialliset Leishmania-lajit (vanhan ja uuden maailman Leishmania-lajit), viisi ihmisille merkittävää Plasmodium-lajia (falciparum, oval, vivax, malaria ja knowlesi) sekä Pneumocystis jiroveci.

1. Positiiviset näytteet Leishmania-amastigooteille perifeerisestä verestä ja/tai luuytimen aspiratista/biopsiasta ja/tai ihon kaavinnasta/biopsiasta, jotka on aiemmin testattu rutiinidiagnostiikkamenetelmillä, testataan spesifisellä kvalitatiivisella PCR-analyysillä käyttäen kaupallista diagnoosikittiä. Lisäksi suorittaisimme DNA-kvantifiointijärjestelmän käyttäen PCR-syklin kynnysarvoa yksittäisestä näytteestä ja virtuaalista asteikkoa, joka kykenee muuttamaan tulokset DNA-kuormaksi (Piralla A et al, J clin virol 2013). Sitten suorittaisimme spesifisen p70-geenin DNA-sekvensoinnin lajin ja kannan määrittämiseksi.
2. Plasmodium-lajien veripositiiviset näytteet, jotka on testattu ja analysoitu suoralla mikroskopialla ja immunokromatografisella testillä, testataan monipuolisella PCR-kaupallisella diagnoosikitillä tai kuvatulla menetelmällä (A.Berg et al, Infection 2020), joka kykenee määrittämään yksittäisen tai sekoitetun infektion ja kvantifioimaan parasitemian. Yksityiskohtaisesti verinäytteet analysoidaan kvalitatiivisella ja kvantitatiivisella PCR-analyysillä Plasmodium spp:lle ja Plasmodium Falciparumille. P. falciparum-DNA:n pitoisuus verinäytteissä mitataan kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä (qPCR) kuten muualla kuvattu (Imwong M, J.clin.microb 2014). Plasmodium falciparum-positiivisissa näytteissä kustakin näytteestä saatujen DNA-kopioiden määrää verrataan suorasta mikroskooppianalyysista saatujen parasitemiatasojen kanssa. Tällä tavoin haluaisimme määrittää DNA-kopioarvojen alueen, joka on verrattavissa eri luokitusasteisiin, joita nykyisin saadaan infektiosta positiivisten punasolujen prosenttiosuuksilla (<5 % vs >5 %). Tällä tavoin olisi mahdollista arvioida parasitemiataso kvantitatiivisilla PCR-tekniikoilla.
3. Lopuksi Pneumocystis jirovecii:n havaitseminen positiivisissa BAL- tai bronkoaspiraatti (BAS) -näytteissä, jotka on saatu suoralla mikroskopialla, analysoidaan uudelleen käyttäen PCR-kaupallista diagnoosikittiä. Kuten aiemmin mainittu, CT-arvo muunnetaan DNA-kuormaksi verrattuna suoran mikroskooppidatan kanssa.