Внедрение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в микробиологию и паразитологию

Наш проект представляет собой наблюдательное ретроспективное и проспективное перекрестное диагностическое пилотное исследование, посвященное сравнению стандартных рутинных лабораторных тестов и новых молекулярно-биологических анализов. В частности, мы будем выявлять основные патогенные виды Leishmania (виды Leishmania Старого и Нового Света), пять видов Plasmodium, представляющих интерес для человека (falciparum, ovale, vivax, malariae и knowlesi), и Pneumocystis jiroveci.

1. Положительные образцы на амастиготы Leishmania в периферической крови и/или аспирате/биопсии костного мозга и/или соскобах/биопсии кожи, ранее проверенные с помощью рутинных диагностических методов, будут протестированы с помощью специфического качественного ПЦР-анализа с использованием коммерческого диагностического набора. Кроме того, мы будем использовать систему количественного определения ДНК с использованием порогового цикла ПЦР для каждого отдельного образца и виртуальную шкалу, способную преобразовать результаты в нагрузку ДНК (Piralla A et al, J clin virol 2013). Затем мы проведем специфическое секвенирование ДНК гена p70 для определения вида и штамма.
2. Образцы крови, положительные на виды Plasmodium, проверенные и проанализированные с помощью прямой микроскопии и иммунохроматографического анализа, будут протестированы с помощью коммерческого диагностического набора для мультиплексной ПЦР или с использованием описанного метода (A.Berg et al, Infection 2020), способного определить единичную или смешанную инфекцию и количественно оценить паразитемию соответственно. Подробно, образцы крови будут проанализированы с помощью качественного и количественного ПЦР-анализа для Plasmodium spp и Plasmodium Falciparum соответственно. Концентрация ДНК P. falciparum в образцах крови будет измерена с помощью количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР), как описано в других источниках (Imwong M, J.clin.microb 2014). В образцах, положительных на Plasmodium falciparum, количество копий ДНК, полученных из каждого образца, будет сравниваться с уровнем паразитемии, полученным при анализе прямой микроскопии. Таким образом, мы хотели бы определить диапазон значений копий ДНК, сопоставимых с различными степенями классификации, которые в настоящее время получают с помощью процентов эритроцитов, положительных на инфекцию (<5% против >5%). Таким образом, можно будет оценить уровень паразитемии с помощью методов количественной ПЦР.
3. Наконец, обнаружение Pneumocystis jirovecii в положительных образцах БАЛ или бронхоаспирата (БАС), полученных с помощью прямой микроскопии, будет повторно проанализировано с использованием коммерческого диагностического набора для ПЦР. Как упоминалось ранее, значение CT будет преобразовано в нагрузку ДНК по сравнению с данными прямой микроскопии.