Einführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Mikrobiologie und Parasitologie

Unser Projekt ist eine beobachtende retrospektive und prospektive Querschnittsdiagnostik-Pilotstudie über den Vergleich zwischen Standard-Routinelabortests und neuen molekularbiologischen Assays. Insbesondere würden wir die wichtigsten Krankheitserreger-Leishmania-Arten (Alte und Neue Welt Leishmania-Arten), die fünf für den Menschen relevanten Plasmodium-Arten (falciparum, oval, vivax, malaria und knowlesi) und Pneumocystis jiroveci nachweisen.

1. Positive Proben für Leishmania-Amastigoten im peripheren Blut und/oder Knochenmarkaspirat/Biopsie und/oder aus Hautabschabungen/Biopsien, die zuvor gemäß Routine-Diagnoseassays getestet wurden, werden mit einer spezifischen qualitativen PCR-Analyse unter Verwendung eines kommerziellen Diagnosekits getestet. Zusätzlich würden wir ein System zur DNA-Quantifizierung unter Verwendung des PCR-Zyklusschwellenwerts der einzelnen Probe und einer virtuellen Skala durchführen, die in der Lage ist, die Ergebnisse in die DNA-Last umzuwandeln (Piralla A et al, J clin virol 2013). Anschließend würden wir eine spezifische DNA-Sequenzierung des p70-Gens durchführen, um die Art und den Stamm zu bestimmen.
2. Plasmodium-Arten-positive Blutproben, die durch Direktmikroskopie und immunochromatographischen Assay getestet und analysiert wurden, werden mit einem Multiplex-PCR-kommerziellen Diagnosekit oder mit einer beschriebenen Methode (A.Berg et al, Infection 2020) getestet, die in der Lage ist, Einzel- oder Mischinfektionen zu bestimmen und die Parasitämie jeweils zu quantifizieren. Im Detail werden die Blutproben mit qualitativer und quantitativer PCR-Analyse für Plasmodium spp bzw. Plasmodium falciparum analysiert. Die Konzentration von P. falciparum-DNA in Blutproben wird durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) gemessen, wie andernorts beschrieben (Imwong M, J.clin.microb 2014). In Plasmodium falciparum-positiven Proben wird die Menge der aus jeder Probe erhaltenen DNA-Kopien mit dem durch Direktmikroskopieanalyse erhaltenen Parasitämiegrad verglichen. Auf diese Weise möchten wir einen Bereich von DNA-Kopiewerten ermitteln, der mit den verschiedenen Klassifizierungsgraden vergleichbar ist, die derzeit mit Prozentsätzen von für die Infektion positiven roten Blutkörperchen erhalten werden (<5% vs >5%). Auf diese Weise könnte es möglich sein, einen Parasitämiegrad mit quantitativen PCR-Techniken zu bewerten.
3. Schließlich wird der Nachweis von Pneumocystis jirovecii in positiven BAL- oder Bronchoaspirat (BAS)-Proben, die durch Direktmikroskopie erhalten wurden, durch Verwendung eines PCR-kommerziellen Diagnosekits erneut analysiert. Wie bereits erwähnt, wird der CT-Wert im Vergleich zu Direktmikroskopiedaten in DNA-Last umgewandelt.