Wprowadzenie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w mikrobiologii i parazytologii

Nasz projekt to obserwacyjne retrospektywne i prospektywne przekrojowe pilotażowe badanie diagnostyczne, dotyczące porównania standardowych rutynowych testów laboratoryjnych z nowymi testami biologii molekularnej.
W szczególności wykrywalibyśmy główne patogenne gatunki Leishmania (gatunki Leishmania Starego i Nowego Świata), pięć gatunków Plasmodium istotnych dla człowieka (falciparum, oval, vivax, malaria i knowlesi) oraz Pneumocystis jiroveci.

1. Próbki pozytywne na amastigoty Leishmania we krwi obwodowej i/lub aspiracie/skrawku szpiku kostnego i/lub ze skrobania/skrawka skóry wcześniej testowane zgodnie z rutynowymi testami diagnostycznymi będą testowane za pomocą specyficznej jakościowej analizy PCR przy użyciu komercyjnego zestawu diagnostycznego.
   Dodatkowo wykonamy system kwantyfikacji DNA wykorzystujący próg cyklu PCR pojedynczej próbki i wirtualną skalę umożliwiającą przeliczenie wyników na obciążenie DNA (Piralla A i in., J clin virol 2013).
   Następnie wykonamy specyficzne sekwencjonowanie DNA genu p70 w celu określenia gatunku i szczepu.
2. Próbki krwi pozytywne na gatunki Plasmodium testowane i analizowane za pomocą bezpośredniej mikroskopii oraz testu immunochromatograficznego, będą testowane za pomocą komercyjnego zestawu diagnostycznego multiplex PCR lub opisaną metodą (A.Berg i in., Infection 2020) umożliwiającą określenie pojedynczej lub mieszanej infekcji oraz kwantyfikację pasożytemii odpowiednio.
   Szczegółowo, próbki krwi będą analizowane za pomocą jakościowej i ilościowej analizy PCR odpowiednio dla Plasmodium spp i Plasmodium Falciparum.
   Stężenie DNA P. falciparum w próbkach krwi będzie mierzone za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) jak opisano gdzie indziej (Imwong M, J.clin.microb 2014).
   W próbkach pozytywnych na Plasmodium falciparum, ilość kopii DNA uzyskanych z każdej próbki będzie porównywana z poziomem pasożytemii uzyskanym z analizy bezpośredniej mikroskopii.
   W ten sposób chcielibyśmy określić zakres wartości kopii DNA porównywalny z różnymi stopniami klasyfikacji, które są obecnie uzyskiwane z procentami czerwonych krwinek pozytywnych na infekcję (<5% vs >5%).
   W ten sposób możliwe byłoby oszacowanie poziomu pasożytemii za pomocą technik ilościowej PCR.
3. Wreszcie, wykrycie Pneumocystis jirovecii w pozytywnych próbkach BAL lub bronchoaspiracie (BAS) uzyskanych za pomocą bezpośredniej mikroskopii będzie ponownie analizowane za pomocą komercyjnego zestawu diagnostycznego PCR.
   Jak wcześniej wspomniano, wartość CT będzie przeliczana na obciążenie DNA w porównaniu z danymi z bezpośredniej mikroskopii.