Introduzione della Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) in Microbiologia e Parassitologia

Il nostro progetto è uno studio pilota diagnostico osservazionale retrospettivo e prospettico trasversale, riguardante il confronto tra i test di laboratorio di routine standard e i nuovi saggi di biologia molecolare. In particolare, rileveremo le principali specie patogene di Leishmania (specie di Leishmania del Vecchio e Nuovo Mondo), le cinque specie di Plasmodium di interesse umano (falciparum, ovale, vivax, malariae e knowlesi) e Pneumocystis jirovecii,

1. I campioni positivi per amastigoti di Leishmania nel sangue periferico e/o aspirato/biopsia del midollo osseo e/o da raschiamento/biopsia cutanea precedentemente testati secondo i saggi diagnostici di routine saranno analizzati con una specifica analisi PCR qualitativa utilizzando un kit diagnostico commerciale. Inoltre, eseguiremo un sistema di quantificazione del DNA utilizzando la soglia del ciclo PCR del singolo campione e una scala virtuale in grado di convertire i risultati nel carico di DNA (Piralla A et al, J clin virol 2013). Successivamente, eseguiremo un sequenziamento specifico del DNA del gene p70 per determinare la specie e il ceppo.
2. I campioni di sangue positivi per specie di Plasmodium testati e analizzati mediante microscopia diretta e saggio immunocromatografico, saranno testati con un kit diagnostico commerciale PCR multiplex o con un metodo descritto (A.Berg et al, Infection 2020) in grado di determinare infezioni singole o miste e di quantificare rispettivamente la parassitemia. Nel dettaglio, i campioni di sangue saranno analizzati con analisi PCR qualitativa e quantitativa rispettivamente per Plasmodium spp e Plasmodium falciparum. La concentrazione di DNA di P. falciparum nei campioni di sangue sarà misurata mediante PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) come descritto altrove (Imwong M, J.clin.microb 2014). Nei campioni positivi per Plasmodium falciparum, la quantità di copie di DNA ottenuta da ciascun campione sarà confrontata con il livello di parassitemia ottenuto dall'analisi di microscopia diretta. In questo modo, vorremmo determinare un intervallo di valori di copie di DNA comparabile ai diversi gradi di classificazione attualmente ottenuti con le percentuali di globuli rossi positivi all'infezione (<5% vs >5%). In questo modo, potrebbe essere possibile valutare un livello di parassitemia con tecniche di PCR quantitative.
3. Infine, il rilevamento di Pneumocystis jirovecii in campioni positivi di BAL o broncoaspirato (BAS) ottenuti mediante microscopia diretta sarà rianalizzato utilizzando un kit diagnostico commerciale PCR. Come precedentemente menzionato, il valore CT sarà convertito in carico di DNA in confronto con i dati di microscopia diretta.