Zavedení polymerázové řetězové reakce (PCR) v mikrobiologii a parazitologii

Náš projekt je observační retrospektivní a prospektivní průřezová diagnostická pilotní studie, která se zaměřuje na srovnání mezi standardními rutinními laboratorními testy a novými molekulárně-biologickými testy. Konkrétně bychom detekovali hlavní patogenní druhy Leishmania (starosvětské a novosvětské druhy Leishmania), pět druhů Plasmodia relevantních pro člověka (falciparum, ovale, vivax, malariae a knowlesi) a Pneumocystis jirovecii.

1. Pozitivní vzorky na Leishmania amastigoty v periferní krvi a/nebo v aspirátu/biopsii kostní dřeně a/nebo v kožním seškrabu/biopsii, které byly dříve testovány podle rutinních diagnostických testů, budou testovány specifickou kvalitativní PCR analýzou pomocí komerčního diagnostického kitu. Kromě toho bychom provedli systém kvantifikace DNA pomocí prahové hodnoty cyklu PCR jednotlivého vzorku a virtuální stupnice schopné převést výsledky na množství DNA (Piralla A et al, J clin virol 2013). Poté bychom provedli specifické sekvenování DNA genu p70 k určení druhu a kmene.
2. Vzorky krve pozitivní na druhy Plasmodia, testované a analyzované přímou mikroskopií a imunochromatografickým testem, budou testovány multiplexním PCR komerčním diagnostickým kitem nebo popsanou metodou (A.Berg et al, Infection 2020), která je schopna určit jednotlivou nebo smíšenou infekci a kvantifikovat parazitémii. Podrobně budou vzorky krve analyzovány kvalitativní a kvantitativní PCR analýzou pro Plasmodium spp a Plasmodium falciparum, resp. Koncentrace DNA P. falciparum ve vzorcích krve bude měřena kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR), jak je popsáno jinde (Imwong M, J.clin.microb 2014). Ve vzorcích pozitivních na Plasmodium falciparum bude množství kopií DNA získané z každého vzorku porovnáno s úrovní parazitémie získanou z analýzy přímou mikroskopií. Tímto způsobem bychom chtěli stanovit rozsah hodnot kopií DNA srovnatelný s různými stupni klasifikace, které jsou v současnosti získávány procenty červených krvinek pozitivních na infekci (<5% vs >5%). Tímto způsobem by bylo možné posoudit úroveň parazitémie pomocí kvantitativních PCR technik.
3. Nakonec bude detekce Pneumocystis jirovecii v pozitivních vzorcích BAL nebo bronchoaspirátu (BAS) získaných přímou mikroskopií přetestována pomocí PCR komerčního diagnostického kitu. Jak již bylo zmíněno, hodnota CT bude převedena na množství DNA ve srovnání s údaji z přímé mikroskopie.