Introduksjon av Polymerase Chain Reaction (PCR) i mikrobiologi og parasitologi

Vårt prosjekt er en observasjonell retrospektiv og prospektiv tverrsnittsdiagnostisk pilotstudie om sammenligningen mellom standard rutinelaboratorietester og nye molekylærbiologiske analyser.
Spesielt vil vi detektere hovedpatogen Leishmania-arter (gamle og nye verdens Leishmania-arter), de fem artene av Plasmodium av menneskelig interesse (falciparum, oval, vivax, malaria og knowlesi) og Pneumocystis jiroveci.

1. Positive prøver for Leishmania-amastigoter i perifert blod og/eller benmargaspirat/biopsi og/eller fra kutant skraping/biopsi tidligere testet i henhold til rutinediagnostiske analyser vil bli testet med en spesifikk kvalitativ PCR-analyse ved bruk av kommersielt diagnostisering-sett.
   I tillegg vil vi utføre et system for DNA-kvantifisering ved bruk av PCR-syklusterskel for den enkelte prøve og en virtuell skala som kan konvertere resultatene til DNA-belastning (Piralla A et al, J clin virol 2013).
   Deretter vil vi utføre en spesifikk DNA-sekvensering av p70-genet for å bestemme art og stamme.
2. Plasmodium-arter blodpositive prøver testet for og analysert ved direkte mikroskopi og immunokromatografisk assay, vil bli testet med multiplex PCR kommersielt diagnostisering-sett eller med en beskrevet metode (A.Berg et al, Infection 2020) som kan bestemme enkelt- eller blandet infeksjon og kvantifisere parasitemien henholdsvis.
   I detalj vil blodprøvene bli analysert med kvalitativ og kvantitativ PCR-analyse for Plasmodium spp og Plasmodium falciparum, henholdsvis.
   Konsentrasjonen av P. falciparum DNA i blodprøver vil bli målt ved kvantitativ real-time PCR (qPCR) som beskrevet andre steder (Imwong M, J.clin.microb 2014).
   I Plasmodium falciparum positive prøver vil mengden DNA-kopier oppnådd fra hver prøve bli sammenlignet med nivået av parasitemi oppnådd fra direkte mikroskopianalyse.
   På denne måten ønsker vi å bestemme et område av DNA-kopiverdier som kan sammenlignes med de ulike gradene av klassifisering som for tiden oppnås med prosentandeler av røde blodceller positive for infeksjonen (<5% vs >5%).
   På denne måten kan det være mulig å vurdere et nivå av parasitemi med kvantitative PCR-teknikker.
3. Endelig vil deteksjon av Pneumocystis jirovecii i positive BAL eller bronkoaspirat (BAS) prøver oppnådd ved direkte mikroskopi bli reanalysert ved bruk av PCR kommersielt diagnostisering-sett.
   Som tidligere nevnt vil CT-verdien bli konvertert til DNA-belastning i sammenligning med direkte mikroskopidata.