Introducción de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en Microbiología y Parasitología

Nuestro proyecto es un estudio piloto de diagnóstico transversal observacional retrospectivo y prospectivo, sobre la comparación entre las pruebas de laboratorio de rutina estándar y los nuevos ensayos de biología molecular. En particular, detectaríamos las principales especies de patógenos de Leishmania (especies de Leishmania del Viejo y Nuevo Mundo), las cinco especies de Plasmodium de interés humano (falciparum, oval, vivax, malaria y knowlesi) y Pneumocystis jiroveci.

1. Las muestras positivas para amastigotos de Leishmania en sangre periférica y/o aspirado/biopsia de médula ósea y/o de raspado/biopsia cutánea previamente analizadas según los ensayos de diagnóstico de rutina se analizarán con un análisis cualitativo de PCR específico utilizando un kit de diagnóstico comercial. Además, realizaríamos un sistema de cuantificación de ADN utilizando el umbral de ciclo de PCR de la muestra individual y una escala virtual capaz de convertir los resultados en la carga de ADN (Piralla A et al, J clin virol 2013). Luego realizaríamos una secuenciación específica de ADN del gen p70 para determinar la especie y la cepa.
2. Las muestras de sangre positivas para especies de Plasmodium analizadas y examinadas mediante microscopía directa y ensayo inmunocromatográfico, se analizarán con un kit de diagnóstico comercial de PCR multiplex o con un método descrito (A.Berg et al, Infection 2020) capaz de determinar infección única o mixta y cuantificar la parasitemia, respectivamente. En detalle, las muestras de sangre se analizarán con análisis cualitativo y cuantitativo de PCR para Plasmodium spp y Plasmodium falciparum, respectivamente. La concentración de ADN de P. falciparum en muestras de sangre se medirá mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) como se describe en otro lugar (Imwong M, J.clin.microb 2014). En muestras positivas de Plasmodium falciparum, la cantidad de copias de ADN obtenidas de cada muestra se comparará con el nivel de parasitemia obtenido del análisis de microscopía directa. De esta manera, nos gustaría determinar un rango de valores de copias de ADN comparable a los diferentes grados de clasificación que actualmente se obtienen con porcentajes de glóbulos rojos positivos para la infección (<5% vs >5%). De esta manera, podría ser posible evaluar un nivel de parasitemia con técnicas de PCR cuantitativa.
3. Finalmente, la detección de Pneumocystis jirovecii en muestras positivas de BAL o broncoaspirado (BAS) obtenidas por microscopía directa se reanalizará utilizando un kit de diagnóstico comercial de PCR. Como se mencionó anteriormente, el valor de CT se convertirá en carga de ADN en comparación con los datos de microscopía directa.