Introduktion af Polymerase Chain Reaction (PCR) i Mikrobiologi og Parasitologi

Vores projekt er et observationsbaseret retrospektivt og prospektivt tværsnitsdiagnostisk pilotstudie om sammenligningen mellem standard rutinelaboratorieprøver og nye molekylærbiologiske analyser.
Især vil vi påvise de vigtigste patogene Leishmania-arter (gamle og nye verdens Leishmania-arter), de fem arter af Plasmodium af menneskelig interesse (falciparum, oval, vivax, malaria og knowlesi) og Pneumocystis jiroveci.

1. Positive prøver for Leishmania amastigoter i perifert blod og/eller knoglemarvsaspirat/biopsi og/eller fra kutant skrabning/biopsi, der tidligere er testet i henhold til rutinediagnostiske analyser, vil blive testet med en specifik kvalitativ PCR-analyse ved hjælp af kommercielt diagnostisk kit.
   Derudover vil vi udføre et system til DNA-kvantificering ved hjælp af PCR-cyklustærsklen for den enkelte prøve og en virtuel skala, der er i stand til at konvertere resultaterne til DNA-mængden (Piralla A et al, J clin virol 2013).
   Derefter vil vi udføre en specifik DNA-sekventering af p70-genet for at bestemme art og stamme.
2. Plasmodium-arter blodpositive prøver, der er testet for og analyseret ved direkte mikroskopi og immunokromatografisk analyse, vil blive testet med multiplex PCR kommercielt diagnostisk kit eller med en beskrevet metode (A.Berg et al, Infection 2020), der er i stand til at bestemme enkelt- eller blandet infektion og henholdsvis kvantificere parasitemien.
   I detaljer vil blodprøverne blive analyseret med kvalitativ og kvantitativ PCR-analyse for henholdsvis Plasmodium spp og Plasmodium falciparum.
   Koncentrationen af P. falciparum DNA i blodprøver vil blive målt ved kvantitativ realtids-PCR (qPCR) som beskrevet andetsteds (Imwong M, J.clin.microb 2014).
   I Plasmodium falciparum positive prøver vil mængden af DNA-kopier opnået fra hver prøve blive sammenlignet med parasiteminiveauet opnået fra direkte mikroskopisk analyse.
   På denne måde ønsker vi at bestemme et interval af DNA-kopiværdier, der kan sammenlignes med de forskellige grader af klassifikation, der i øjeblikket opnås med procenter af røde blodlegemer positive for infektionen (<5% vs >5%).
   På denne måde kunne det være muligt at vurdere et niveau af parasitemi med kvantitative PCR-teknikker.
3. Endelig vil påvisning af Pneumocystis jirovecii i positive BAL- eller bronkoaspirat (BAS) prøver opnået ved direkte mikroskopi blive genanalyseret ved hjælp af PCR kommercielt diagnostisk kit.
   Som tidligere nævnt vil CT-værdien blive konverteret til DNA-mængde i sammenligning med direkte mikroskopidata.