Introductie van Polymerase Chain Reaction (PCR) in Microbiologie en Parasitologie

Ons project is een observationele retrospectieve en prospectieve cross-sectionele diagnostische pilotstudie, over de vergelijking tussen standaard routinematige laboratoriumtests en nieuwe moleculairbiologische assays. In het bijzonder zouden we de belangrijkste pathogene Leishmania-soorten (Oude en Nieuwe Wereld Leishmania-soorten), de vijf soorten Plasmodium van menselijk belang (falciparum, oval, vivax, malaria en knowlesi) en Pneumocystis jiroveci detecteren,

1. Positieve monsters voor Leishmania-amastigoten in perifeer bloed en/of beenmergaspiraat/biopsie en/of van cutane afkrabsel/biopsie die eerder volgens routinematige diagnostische assays zijn getest, zullen worden getest met een specifieke kwalitatieve PCR-analyse door gebruik te maken van een commerciële diagnostische kit. Daarnaast zouden we een systeem van DNA-kwantificering uitvoeren met behulp van de PCR-cyclusdrempel van het individuele monster en een virtuele schaal die de resultaten kan omzetten in de DNA-lading (Piralla A et al, J clin virol 2013). Vervolgens zouden we een specifieke DNA-sequencing van het p70-gen uitvoeren om de soort en de stam te bepalen.
2. Plasmodium-soort bloedpositieve monsters die zijn getest en geanalyseerd door directe microscopie en immunochromatografische assay, zullen worden getest met een multiplex PCR commerciële diagnostische kit of met een beschreven methode (A.Berg et al, Infection 2020) die in staat is om enkele of gemengde infectie te bepalen en respectievelijk de parasitemie te kwantificeren. In detail zullen de bloedmonsters worden geanalyseerd met kwalitatieve en kwantitatieve PCR-analyse voor respectievelijk Plasmodium spp en Plasmodium Falciparum. De concentratie van P. falciparum DNA in bloedmonsters zal worden gemeten door kwantitatieve real-time PCR (qPCR) zoals elders beschreven (Imwong M, J.clin.microb 2014). In Plasmodium falciparum positieve monsters zal de hoeveelheid DNA-kopieën verkregen van elk monster worden vergeleken met het niveau van parasitemie verkregen uit directe microscopieanalyse. Op deze manier zouden we een reeks van DNA-kopiewaarden willen bepalen die vergelijkbaar zijn met de verschillende graden van classificatie die momenteel worden verkregen met percentages rode bloedcellen positief voor de infectie (<5% vs >5%). Op deze manier zou het mogelijk kunnen zijn om een niveau van parasitemie te beoordelen met kwantitatieve PCR-technieken.
3. Ten slotte zal detectie van Pneumocystis jirovecii in positieve BAL of bronchoaspiraat (BAS) monsters verkregen door directe microscopie opnieuw worden geanalyseerd door gebruik te maken van PCR commerciële diagnostische kit. Zoals eerder vermeld, zal de CT-waarde worden omgezet in DNA-lading in vergelijking met directe microscopiegegevens.