Introdução da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em Microbiologia e Parasitologia

O nosso projeto é um estudo piloto de diagnóstico observacional retrospetivo e prospetivo transversal, sobre a comparação entre testes laboratoriais de rotina padrão e novos ensaios de biologia molecular. Em particular, detetaríamos as principais espécies patogénicas de Leishmania (espécies de Leishmania do Velho e do Novo Mundo), as cinco espécies de Plasmodium de interesse humano (falciparum, ovale, vivax, malariae e knowlesi) e Pneumocystis jirovecii.

1. Amostras positivas para amastigotas de Leishmania em sangue periférico e/ou aspirado/biópsia de medula óssea e/ou de raspado/biópsia cutânea previamente testadas de acordo com os ensaios de diagnóstico de rotina serão testadas com uma análise PCR qualitativa específica utilizando um kit de diagnóstico comercial. Além disso, realizaríamos um sistema de quantificação de ADN utilizando o limiar de ciclo de PCR da amostra individual e uma escala virtual capaz de converter os resultados na carga de ADN (Piralla A et al, J clin virol 2013). De seguida, realizaríamos um sequenciamento específico de ADN do gene p70 para determinar a espécie e a estirpe.
2. Amostras de sangue positivas para espécies de Plasmodium testadas e analisadas por microscopia direta e ensaio imunocromatográfico, serão testadas com um kit de diagnóstico PCR multiplex comercial ou com um método descrito (A.Berg et al, Infection 2020) capaz de determinar infeção única ou mista e de quantificar a parasitemia, respetivamente. Em detalhe, as amostras de sangue serão analisadas com análise PCR qualitativa e quantitativa para Plasmodium spp e Plasmodium falciparum, respetivamente. A concentração de ADN de P. falciparum nas amostras de sangue será medida por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) conforme descrito noutro local (Imwong M, J.clin.microb 2014). Em amostras positivas para Plasmodium falciparum, a quantidade de cópias de ADN obtidas de cada amostra será comparada com o nível de parasitemia obtido da análise de microscopia direta. Desta forma, gostaríamos de determinar um intervalo de valores de cópias de ADN comparável aos diferentes graus de classificação que são atualmente obtidos com percentagens de glóbulos vermelhos positivos para a infeção (<5% vs >5%). Desta forma, poderia ser possível avaliar um nível de parasitemia com técnicas de PCR quantitativa.
3. Finalmente, a deteção de Pneumocystis jirovecii em amostras positivas de LBA ou broncoaspirado (BAS) obtidas por microscopia direta será reanalisada utilizando um kit de diagnóstico PCR comercial. Como mencionado anteriormente, o valor de CT será convertido em carga de ADN em comparação com os dados de microscopia direta.