Metagenomica clinica dell'endocardite infettiva (Meta-ENDO)

Contesto e fondamento logico L'endocardite infettiva (IE) è un'infezione delle valvole cardiache. IE coinvolge principalmente batteri, più raramente funghi. L'IE è una malattia rara con un'incidenza stimata di 1-12 casi ogni 100.000 abitanti all'anno. La diagnostica dell'IE si basa sul prelievo di campioni biologici (emocolture e prelievi peroperatori) e sulla loro coltura nel laboratorio di batteriologia, denominati metodi convenzionali.

Questo processo, praticamente immutato dai tempi di Pasteur alla fine del XIX secolo, ha lo svantaggio di consentire l'unica rilevazione dei batteri che possono essere coltivati ​​nelle condizioni abituali di un laboratorio. Se la maggior parte dei batteri patogeni può farlo, alcuni batteri che possono essere coinvolti nell'EI (ad es. Coxiella sp., Bartonella sp., Tropheryma whipplei) richiedono condizioni molto specifiche per moltiplicarsi. Inoltre, la precedente assunzione di antibiotici da parte del paziente prima del prelievo del campione può influenzare negativamente la coltura dei campioni. La diagnosi di EI viene evocata considerando una serie di argomenti clinici (febbre, comportamento a rischio microbiologico (emocoltura(e) positiva), sierologia (per Coxiella burnettii), ecografia (presenza di una massa intracardiaca, ascesso, perdite e/o disinserimento di una valvola), che sono tutti criteri minori e maggiori per determinare la certezza di EI. Il trattamento dell'EI si basa su antibiotici prolungati (da 4 a 6 settimane per la maggior parte dei casi) e chirurgia valvolare (secondo precise indicazioni).

In circa il 10% dei casi, tuttavia, le emocolture rimangono negative. Questi sono noti come IE di coltura negativa, che possono essere dovuti ad antibiotici presi prima del campionamento, a batteri non coltivabili oa fenomeni asettici. È quindi possibile utilizzare la PCR ad ampio raggio che consiste nell'amplificazione mediante PCR e quindi nel sequenziamento di una frazione del gene codificante per l'RNA 16S. Permette l'identificazione del batterio patogeno, ma non dà informazioni su eventuali resistenze acquisite agli antibiotici.

Concetto di metagenomica clinica La metagenomica clinica è definita come l'applicazione del sequenziamento ad alto rendimento (NGS) seguita da un'analisi bioinformatica specifica per ottenere informazioni cliniche, ovvero l'identificazione dei patogeni e la previsione della loro suscettibilità agli antimicrobici. Il metagenoma di un campione (es. tutti i genomi degli organismi presenti) contiene virtualmente tutte le informazioni necessarie alla diagnosi batteriologica: cosa è/sono il/i batterio/i patogeno/i, e a quali antibiotici è/sono suscettibile/i. Il concetto di metagenomica clinica si è sviluppato parallelamente alle nuove tecnologie di sequenziamento del DNA introdotte a metà degli anni 2000 e molto più efficienti in termini di throughput rispetto al metodo di sequenziamento descritto da Sanger. Sebbene questo concetto sia attraente, ci sono ancora molti ostacoli alla sua attuazione. In primo luogo, i campioni clinici di infezioni batteriche di solito contengono un'alta concentrazione di leucociti, il cui genoma è circa 1000 volte più grande di quello dei batteri. Pertanto, il primo passo limitante per la metagenomica clinica è la necessità di ottenere DNA batterico sufficiente per consentire la preparazione di librerie di qualità per il sequenziamento, ma anche per ridurre la concentrazione di DNA umano il cui sequenziamento non è necessario in questo contesto. I metodi sono disponibili ma la loro valutazione ai fini della metagenomica clinica è necessaria. In secondo luogo, la complessità dei dati bioinformatici che devono essere gestiti da un microbiologo richiede che i dati siano sfruttati nel modo più automatizzato possibile insieme a un'interfaccia user-friendly, cosa che non avviene oggi anche se si stanno sviluppando piattaforme online. L'assegnazione tassonomica delle sequenze, il loro assemblaggio, l'identificazione di geni e mutazioni cromosomiche associate alla resistenza agli antibiotici e la creazione di un legame tra il determinante della resistenza e il batterio ospite sono ulteriori ostacoli all'implementazione della metagenomica clinica. Infine, se il tempo impiegato per ottenere risultati sfruttabili dal microbiologo tende a diminuire, esso è ormai paragonabile a quello della coltura, con un costo molto più elevato. Tuttavia, la concorrenza sostenuta tra i produttori di sequencer dovrebbe mantenere il loro declino, come è avvenuto nell'ultimo decennio.

Rilevanza dell'uso della metagenomica clinica in IE

L'uso della metagenomica clinica nel contesto dell'IE sembra quindi rilevante per diversi motivi:

• La maggior parte delle IE sono monomicrobiche, il che supporta le buone prestazioni della metagenomica clinica secondo i nostri risultati preliminari.
• La coltura dei campioni intraoperatori eseguita in un contesto di IE è talvolta negativa, a causa del pretrattamento antibiotico e/o della mancata coltura nelle condizioni di routine del patogeno (es. Bartonella spp o Coxiella spp.), lasciando margini di miglioramento.
• Il trattamento dell'IE è un trattamento a lungo termine che richiede una diagnosi accurata in accordo con la suscettibilità dei patogeni agli antibiotici. Se l'agente patogeno non viene trovato in coltura, al paziente devono essere somministrati antibiotici ad ampio spettro con un doppio rischio di fallimento del trattamento e di tossicità. Tuttavia, la metagenomica clinica potrebbe fornire informazioni sulla sensibilità agli antibiotici anche nel caso di una coltura negativa.
• Nella maggior parte dei casi, la diagnosi microbiologica di IE non è una diagnosi di emergenza, compatibile con l'uso della metagenomica clinica per la quale il tempo di attuazione è al massimo di 48-72 ore.

Pertanto, proponiamo di valutare le prestazioni della metagenomica clinica nella diagnostica dell'IE.