Interazioni tra cellule immunitarie polmonari e microbioma nel polmone sano (ILLUMINA-2)

La pandemia di coronavirus 2019, causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2, ha portato con sé diversi studi sul sistema immunitario polmonare locale, che fino a poco tempo fa era in gran parte una terra incognita. Con questi nuovi metodi sono stati scoperti aspetti apparentemente fondamentali della malattia polmonare, inclusa l'iperinfiammazione polmonare. Tuttavia, attualmente si sa molto poco sulla composizione della normale popolazione di cellule immunitarie nel polmone umano, inclusa la sua interazione con il microbioma polmonare, cioè il microbiota commensale di batteri e funghi interagenti che risiedono all'interno del polmone sano

Disegno complessivo: In 50 pazienti (25 maschi, 25 femmine), intubati per chirurgia elettiva in anestesia generale, sarà ottenuto un aspirato endotracheale e fluido BAL (BALF) da segmenti polmonari separati. Inoltre, verranno raccolti un tampone orale e nasale e campioni di sangue. Questo sarà fatto immediatamente dopo l'intubazione.

Dalla cartella clinica elettronica del paziente si ricavano: codici diagnosi e medicazione (tipologia e posologia), anamnesi di tabagismo (attuale/precedente/non fumatore; pack anni), tipologia di intervento; inoltre, la cartella sanitaria è vagliata per eventuali criteri di esclusione

I campioni di sangue vengono prelevati dal catetere venoso periferico del paziente (inserito per scopi clinici) immediatamente prima della raccolta del BALF.

Broncoscopia con raccolta BALF: questa procedura viene eseguita in modo standardizzato secondo le attuali linee guida cliniche. Immediatamente prima della procedura, si ottengono un tampone orale, un tampone nasale e un aspirato endotracheale (ETA). La FIO2 viene quindi aumentata a 1,0 e la procedura di broncoscopia viene eseguita utilizzando un videoscopio monouso con un diametro esterno di 5,0 mm). Tre successive aliquote da 50 ml di soluzione salina isotonica preriscaldata (37°C) vengono instillate nel segmento mediale del lobo medio destro, aspirate immediatamente con bassa pressione di aspirazione negativa (< 100 cm H2O) e riunite in un contenitore di vetro sterile su ghiaccio per ottenere un campione BALF.

Successivamente viene eseguito un mini-BAL nel lobo superiore e inferiore del polmone destro con un'unica installazione di 20 ml di soluzione fisiologica isotonica in ciascun lobo con aspirazione immediata in un contenitore sterile.

Misure: la composizione della popolazione di cellule immunitarie, così come la funzione e la differenziazione di varie linee cellulari saranno studiate mediante sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) su cellule immunitarie selezionate da BALF, ETA e sangue, e questo essere integrato dal sequenziamento di massa dell'RNA con codice a barre del campione e multiplexing, fornendo un pattern di espressione dettagliato di tutti i campioni.

La composizione del microbioma in BALF, ETA e tamponi orali sarà valutata mediante sequenziamento mirato dell'amplicone delle regioni ipervariabili da 1 a 3 della subunità 16S del gene dell'RNA ribosomiale per i batteri.

Analisi statistiche: saranno eseguite utilizzando il software statistico R versione 4.1.1 (R Project for Statistical Computing) all'interno del software statistico RStudio versione 1.4.1717 (RStudio) e p<0,05 considerati statisticamente significativi. L'ispezione della normalità e dell'omogeneità della varianza sarà effettuata creando qq-plot e istogrammi. Verranno utilizzati gli strumenti di inferenza statistica SPIEC-EASI e HeatMaps e, sulla base di analisi correlazionali, verranno applicate analisi dei componenti principali, inclusa l'analisi dei cluster non gerarchici, per identificare i tratti.