DENND1A.V2 urinario come predittore di iperandrogenemia puberale (DENND1A)

Ad oggi, i meccanismi alla base della produzione eccessiva di androgeni da parte dei tessuti produttori di steroidi non sono stati chiari, ma recenti studi di Genome Wide Association (GWAS) hanno fornito ulteriori dati al riguardo. I dati iniziali di GWAS in una popolazione cinese Han hanno identificato circa 12 loci come potenziali candidati del gene di suscettibilità della PCOS. Uno di questi loci, il locus DENND1A in 9q22.32, è stato replicato negli studi GWAS sia nelle popolazioni asiatiche che in quelle europee. Strauss e colleghi hanno recentemente dimostrato l'espressione di DENND1A nei testicoli, nelle cellule della teca ovarica e nelle cellule del carcinoma surrenale H295, tutti tessuti/cellule che producono androgeni. DENND1A è quindi un candidato gene di suscettibilità PCOS estremamente forte. Tuttavia, non è chiaro come DENND1A possa contribuire al fenotipo della PCOS.

È importante sottolineare che esistono due forme trascrizionali del gene DENND1A, una conseguenza dello splicing alternativo. Il trascritto più grande (DENND1A Variante 1, o DENND1A.V1) codifica una proteina di 1009 amminoacidi, mentre il trascritto più piccolo DENND1A.V2 codifica un amminoacido troncato di 559. Il prodotto di DENND1A.V2 contiene il dominio DENN e un dominio legante la clatrina, ma differisce dal prodotto di DENND1A.V1 in due modi: (1) non contiene il dominio C-terminale ricco di prolina presente nella variante 1, e (2) DENND1A.V2 risulta dallo splicing differenziale e contiene un'unica sequenza C-terminale di 33 amminoacidi. Di notevole interesse, gli studi pubblicati dai Drs. McAllister e Strauss (McAllister JM, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:E1519-27) implicano fortemente la variante di splicing DENND1A.V2 come contributore all'eccessiva produzione di androgeni delle cellule della teca nella PCOS:

• L'espressione della proteina DENND1A.V2 nelle cellule della teca in coltura isolate da donne con PCOS era più di 3 volte elevata rispetto alle normali cellule della teca ovarica. Allo stesso modo, l'abbondanza di mRNA di DENND1A.V2 era elevata nella PCOS teca e correlata con l'aumento della produzione di androgeni delle cellule della teca (deidroepiandrosterone [DHEA]).
• L'espressione forzata di DENND1A.V2 nelle normali cellule della teca ha aumentato l'espressione di CYP17A1 e CYP11A1 (geni per enzimi steroidogenici chiave) insieme al precursore androgeno/androgeno (ad es. 17OHP4, DHEA, testosterone) e alla produzione di progesterone.
• Il knockdown di DENND1A.V2 nelle cellule della teca PCOS in coltura ha ridotto l'espressione di CYP17A1 e CYP11A1 oltre alla produzione di 17OHP4 e DHEA.
• Il trattamento delle cellule della teca PCOS in coltura con anticorpi IgG anti-DENND1A.V2 ha ridotto l'espressione dell'espressione dell'mRNA di CYP17A1 e CYP11A1, nonché la sintesi di DHEA e 17OHP4.

Questi dati forniscono un forte supporto alla tesi secondo cui la variante di splicing DENND1A.V2 è un fattore importante alla base del fenotipo delle cellule della teca PCOS in coltura e, quindi, dell'eziologia dell'iperandrogenemia ovarica nella PCOS. Per estensione, la variante di splicing DENND1A.V2 può contribuire in modo significativo all'iperandrogenemia peripubertale e può spiegare gran parte dell'iperandrogenemia variabile osservata nelle ragazze peripuberali obese. I ricercatori propongono che, in alcune ragazze peripubertali, l'aumentata espressione di DENND1A.V2 nelle cellule ovariche e/o surrenali promuova la secrezione di androgeni in eccesso con l'avvento della pubertà (quando la stimolazione ovarica da parte dell'LH aumenta) e/o in presenza di obesità (ad es. , aumento della secrezione di insulina, aumento della sintesi di androgeni ovarici stimolati da LH e/o sintesi di androgeni surrenali stimolati da ACTH).

Di grande interesse, i dati preliminari di 5 donne normali e 6 donne con PCOS hanno suggerito che l'mRNA esosomiale urinario DENND1A.V2 era circa 3 volte elevato nelle donne con PCOS rispetto ai controlli normalmente in bicicletta (McAllister JM, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:E1519-27). Gli esosomi sono piccole vescicole (40-100 nm) che contengono acidi nucleici rilasciati dalle cellule nel sangue e nelle urine e sono noti per essere una fonte stabile di RNA. Pertanto, la quantità urinaria esosomiale di DENND1A.V2 può fungere da marker dell'attività di DENND1A.V2 nell'ovaio/surrene.

In questi studi proposti, i ricercatori (compresi i collaboratori Drs. McAllister e Strauss) otterranno l'urina per la quantificazione dell'mRNA exosomal DENND1A.V2 oltre ai campioni di sangue per misurare i livelli di androgeni, LH e insulina (gli ultimi due hanno dimostrato in precedenza di prevedere il testosterone libero). Gli investigatori verificheranno l'ipotesi che la quantità di mRNA esosomiale urinario DENND1A.V2 sia un predittore forte e indipendente dei livelli di androgeni nelle ragazze peripuberali.

A conoscenza degli investigatori, non esistono dati che colleghino un candidato gene di suscettibilità PCOS all'iperandrogenemia puberale. I ricercatori propongono di valutare un nuovo biomarcatore (mRNA esosomiale urinario DENND1A.V2) come predittore del testosterone libero nelle ragazze puberali. La valutazione di questo biomarcatore negli adolescenti è altamente innovativa.

La presente proposta si baserà sull'obiettivo 3 del progetto 1 (NIH P50 HD28934), in cui i ricercatori valutano attentamente i determinanti dell'iperandrogenemia nelle ragazze con obesità peripubertale. In particolare, l'obiettivo 3 è un protocollo intensivo che prevede (a) frequenti prelievi di sangue durante la notte per LH e insulina insieme a (b) protocolli di stimolazione ovarica e surrenale nei successivi 2 giorni. Alcuni dei soggetti che partecipano a questo studio pilota proposto parteciperanno anche all'obiettivo 3. La correlazione tra l'mRNA di DENND1A.V2 esosomiale urinario e i protocolli di stimolazione ovarica/surrenale consentirà una valutazione preliminare dell'mRNA di DENND1A.V2 esosomiale urinario come misura non invasiva di steroidogenesi ovarica/surrenale - uno strumento clinico potenzialmente importante.

Si ritiene che le ragazze peripuberali con iperandrogenemia siano ad alto rischio di sviluppare PCOS adolescenziale/adulta, ma poiché le manifestazioni di PCOS possono sovrapporsi ai risultati della pubertà normale, la diagnosi di PCOS può essere inaffidabile fino alla tarda adolescenza. Se l'mRNA esosomiale urinario DENND1A.V2 è un predittore significativo di iperandrogenemia in questa coorte, studi futuri determineranno l'utilità del DENND1A.V2 esosomiale urinario come test diagnostico per prevedere lo sviluppo della PCOS durante la pubertà. Si tratta di una prospettiva innovativa ed estremamente entusiasmante che potrebbe avere implicazioni potenziali significative per le ragazze a rischio.