Somministrazione di Desferal per migliorare la reazione compromessa all'ipossia nel diabete (DESIRED)

Contesto Le complicanze del diabete rappresentano la principale preoccupazione per la moderna terapia del diabete ed è diventata una priorità caratterizzare ulteriormente i meccanismi fisiopatologici di queste complicanze per garantire lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche razionali.

Sebbene l'esposizione prolungata dei tessuti all'iperglicemia sia il principale fattore causale delle complicanze croniche del diabete, recentemente è diventato sempre più evidente che anche l'ipossia svolge un ruolo importante in tutte le complicanze del diabete. Una bassa concentrazione tissutale di ossigeno nel diabete è la conseguenza di diversi meccanismi (per es., scarso afflusso di sangue secondario a malattie micro e macrovascolari, scarsa diffusione locale di ossigeno secondaria a edema locale o come risultato di un aumento del consumo di ossigeno).

Le risposte adattative delle cellule all'ipossia sono mediate da Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF), che è un fattore di trascrizione eterodimerico, composto da due subunità (subunità alfa e beta) entrambe costitutivamente espresse nelle cellule di mammifero. Nella normossia, l'HIF-1α viene continuamente degradato dal sistema ubiquitina-proteasoma come conseguenza dell'idrossilazione dipendente dall'ossigeno di due residui chiave di prolina catalizzati da un gruppo di enzimi chiamati prolil-idrossilasi (PHD). Sotto ipossia, quando la via di degradazione viene soppressa e l'HIF-1α è stabilizzato, trasloca nel nucleo dove induce più di 800 geni che sono

coinvolti nell'angiogenesi, nel metabolismo energetico glicolitico, nella proliferazione cellulare e nella sopravvivenza che consentono alle cellule di adattarsi alla ridotta disponibilità di ossigeno. HIF-1 è fondamentale per l'espressione di diversi fattori di crescita angiogenici (es. come fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), eritropoietina (EPO) e fattore-1α derivato da cellule stromali (SDF-1α) e per il reclutamento di cellule progenitrici endoteliali (EPC). Recentemente, è stato proposto che i microRNA (es. mir210) mediano anche una parte delle funzioni HIF-1.

I PHD che controllano la stabilità e la funzione dell'HIF 1 α sono enzimi dipendenti da Fe 2+ e/o O2 e la loro attività potrebbe essere inibita dall'esaurimento del ferro. La deferoxamina (DFO), che è un chelante del ferro, induce quindi l'accumulo di HIF-1α e i geni di risposta all'ipossia nella normossia sia in vitro che in vivo essendo in grado di ripristinare la reazione adattativa repressa all'ipossia in diversi modelli animali di diabete. La DFO è in uso clinico da decenni per il trattamento dell'eccessiva deposizione di ferro secondaria a diverse patologie (talassemia, mielosclerosi ecc.) ed è stata utilizzata come strumento farmacologico per indurre risposte HIF dipendenti.

Nell'ultimo decennio sono state raccolte diverse evidenze che evidenziano che nel diabete c'è una risposta cellulare difettosa all'ipossia. Una risposta alterata all'ipossia è presente in tutti i tessuti che sviluppano complicanze sia nei modelli animali per il diabete che nei pazienti con diabete come conseguenza di una segnalazione HIF difettosa. È un effetto diretto dell'iperglicemia che reprime direttamente la stabilità e la funzione dell'HIF a più livelli.

La reazione compromessa recentemente descritta all'ipossia nel diabete ha conseguenze potenzialmente importanti nelle sfide ipossiche acute come infarto cardiaco acuto, ictus, ischemia degli arti (noto per avere una prognosi peggiore nel diabete) ma anche nella sottile regolazione del sistema cardiovascolare e respiratorio come conseguenza di neuropatia autonomica con potenziale grave effetto prognostico sugli eventi cardiovascolari tardivi. Diversi studi hanno affrontato le risposte cardiovascolari all'ipossia intermittente (IH) rispetto all'esposizione alla normossia nei pazienti con diabete. Al fine di stabilire l'adeguatezza della reazione cardiovascolare all'ipossia nel diabete, sono state recentemente studiate le risposte cardiorespiratorie e angiogenetiche nei confronti dell'IH nei pazienti con diabete rispetto ai soggetti di controllo non diabetici abbinati (HYKRAND numero di approvazione etica 2015/1182-31/4) . I risultati preliminari (non pubblicati) hanno mostrato diversi difetti nella reazione sia acuta che ritardata dei pazienti con diabete rispetto ai controlli. La sensibilità baroriflessa (BRS), che è un marker di rischio cardiovascolare e prognosi di sopravvivenza dopo eventi cardiovascolari, è risultata ridotta nei pazienti con diabete dopo IH rispetto ai soggetti non diabetici. Sia il numero di cellule precursori endoteliali (EPC) che i livelli del loro principale stimolatore fattore derivato stromale (SDF-1α) erano diminuiti in risposta all'IH nei diabetici rispetto ai soggetti non diabetici confermando la peggiore capacità di riparare le lesioni ischemiche nel diabete.

Il progetto qui proposto studia il potenziale del DFO (noto per migliorare la segnalazione ipossica dipendente da HIF) per invertire la risposta cardiorespiratoria e angiogenetica compromessa nei pazienti diabetici.

Progetto di ricerca. Si tratta di uno studio cross-over randomizzato in cieco che indaga l'efficacia della DFO (50 mg/kg) rispetto alla soluzione salina isotonica somministrata per via endovenosa prima dell'ipossia intermittente (IH) per migliorare la risposta cardiorespiratoria e angiogenetica nei pazienti con diabete. L'IH consisterà in cinque periodi ipossici (frazione inspirata di ossigeno al 13% di O2) ciascuno della durata di 6 minuti, con cinque intervalli normossici della stessa durata (come utilizzato nello studio HYKRAND) in 30 pazienti con diabete di tipo 1 senza segni clinici di alcuna complicazione. Lo studio verrà eseguito per 4 giorni con una separazione minima di 2 mesi tra i 2 ricoveri per garantire un lavaggio sufficiente e ripristinare i depositi di ferro.

Metodi Disegno dello studio Si tratta di uno studio randomizzato, in doppio cieco, condotto su pazienti con diabete di tipo 1 senza complicanze croniche.

I pazienti saranno randomizzati (mediante randomizzazione a blocchi) (httpps://www.sealedenvelope.com/ simple-randomiser/v1/lists) a (A) trattamento Desferal (DFO) o (B) trattamento salino isotonico.

Sia i pazienti che il personale saranno accecati dal gruppo di trattamento del paziente.

Ai soggetti verrà consigliato di astenersi dalle bevande contenenti caffeina per 12 ore e dall'alcol per 36 ore prima del test

Giorno 1: i campioni di sangue al basale saranno raccolti al mattino e successivamente i pazienti riceveranno Desferal (50 mg/kg) / infusione di soluzione salina s.c per 6 ore. Durante l'ultima ora di infusione i soggetti saranno esposti a ipossia intermittente (IH). Saranno eseguiti campioni di sangue e misurazioni cardiovascolari e respiratorie (CR) (come descritto di seguito) immediatamente prima e in diversi momenti dopo l'IH.

Giorno 2: I campioni di sangue saranno raccolti al mattino. L'esposizione IH consiste in cinque periodi ipossici (frazione inspirata di ossigeno al 13% di O2) ciascuno della durata di 6 minuti, con cinque intervalli normossici della stessa durata (totalmente 1 ora).

Giorno 1: la pressione sanguigna, la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno arterioso vengono misurate continuamente. In caso di diminuzione della saturazione di ossigeno dell'80% o insorgenza di sintomi, l'ipossia viene interrotta fino a quando i livelli di ossigeno raggiungono almeno l'80%. Un tecnico regola e controlla i periodi di respirazione sotto la supervisione di un medico in modo che l'intervento non possa essere osservato dal paziente. Successivamente, verranno eseguite tre sessioni di misurazione: immediatamente dopo (t2), dopo 3 ore (t3) e dopo 6 ore (t4). Dopo t2, ogni paziente ha ricevuto un pasto individuale in base al fabbisogno dietetico.

Test cardiovascolari e respiratori.

Valutazione della sensibilità baroriflessa. Tutti i pazienti saranno testati in posizione supina in una stanza silenziosa a temperatura confortevole. Prima che i partecipanti vengano collegati a un circuito di respirazione attraverso un boccaglio con un filtro antibatterico, verrà eseguita la respirazione spontanea dell'aria della stanza a riposo per 4 minuti al fine di ottenere dati di riferimento.

Durante ciascuna condizione, verrà eseguita la misurazione continua della saturazione di ossigeno (SaO2) mediante un pulsossimetro e della CO2 di fine espirazione (CO2-et) utilizzando un capnografo collegato a un boccaglio. Le registrazioni dell'elettrocardiogramma verranno eseguite mediante derivazioni toraciche e la pressione sanguigna continua non invasiva verrà registrata utilizzando il metodo del bracciale. Due cinture (posizionate attorno al torace e all'addome) monitoreranno i movimenti respiratori del torace. Uno pneumotacografo sarà collegato a un trasduttore di pressione differenziale e inserito in serie al componente espiratorio del sistema di rirespirazione per misurare il flusso delle vie aeree.

La sensibilità baroriflessa (BRS) sarà misurata durante la respirazione spontanea ad ogni sessione di misurazione. Poiché gli studi precedenti non hanno documentato una migliore performance di un metodo rispetto agli altri, la media di sette diversi metodi: sequenze positive e negative, il coefficiente a nelle bande di bassa e alta frequenza e la sua media, la tecnica della funzione di trasferimento, e verrà calcolato il rapporto tra SD dell'intervallo R-R e variabilità della pressione arteriosa sistolica. Oltre alla BRS, è stata applicata la SD dell'intervallo RR (SDNN) per determinare un indice globale di variabilità della frequenza cardiaca. Questa selezione viene effettuata in base al fatto che la distribuzione normale è più pronunciata in questa variabile rispetto ad altri indici di variabilità (ad esempio, la varianza).

La risposta ventilatoria ipossica (HVR) e la risposta ventilatoria ipercapnica (HCVR) saranno valutate per determinare l'attività del sistema respiratorio.

La funzione autonomica cardiovascolare sarà determinata eseguendo quattro test secondo le recenti linee guida: respirazione profonda, rapporto 30:15, manovra di Valsalva e risposta della pressione arteriosa sistolica alla posizione eretta. La neuropatia autonomica cardiovascolare sarà definita come la "presenza di due o più test anomali".

La sensibilità baroriflessa (BRS) sarà valutata prima (t1), immediatamente dopo (t2), 3 ore (t3) e 6 ore (t4) dopo IH.

Il potenziale angiogenetico sarà valutato agli stessi endpoint e dopo 24 ore (giorno N3) misurando nel siero le citochine rilevanti che sono bersagli genici per HIF-1 (es. Fattore di crescita endoteliale vascolare (AVEGFA), fattore 1a derivato da cellule stromali (SDF-1a), eritropoietina ecc.). La risposta diretta del segnale HIF sarà valutata dai livelli sierici di mir210 regolati esclusivamente da HIF.

La risposta EPC sarà valutata allo stesso tempo mediante l'analisi FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting) del numero di antigeni delle cellule progenitrici ematopoietiche (CD34+)/antigene CD133/recettore del dominio dell'inserto chinasi (KDR+)