Profilo di espressione delle chinasi ERK5 e PKM2 nelle malattie neuroinfiammatorie. (NEUROKINASE)

Verrà valutato lo studio dell'espressione delle chinasi ERK5 e PKM2 in pazienti seguiti per RR MS o GBS, all'inizio della patologia.

Verrà eseguito il consueto iter diagnostico per SM e GBS al fine di classificare i pazienti in 4 gruppi:

• Gruppo 1: gruppo di controllo. Pazienti che non soddisfano i criteri per SM o GBS e nei quali non è stata fatta diagnosi differenziale.

I sottogruppi 1a e 1b saranno formati dal rispettivo accoppiamento con i gruppi 2 e 3.

• Gruppo 2: pazienti con SM RR confermata dai criteri Macdonald (2017)
• Gruppo 3: pazienti con GBS confermati dall'associazione dei soliti segni clinici ed elettrofisiologici.
• Gruppo 4: pazienti nei quali è stata identificata una diagnosi differenziale per spiegare i sintomi. Questi pazienti saranno esclusi dall'analisi.

Un ulteriore campione di sangue (25 mL) e un campione di liquido cerebrospinale (CSF) (2 mL) verranno prelevati da tutti i pazienti per studiare i parametri di laboratorio di questo studio. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ei neutrofili saranno isolati dal sangue utilizzando un gradiente di Percoll. I campioni del gruppo 4 non saranno analizzati.

L'analisi si concentrerà sul confronto dei parametri di laboratorio tra il gruppo 2 e 3, tra il gruppo 1a e 2 e tra 1b e 3.

1. / Espressione delle chinasi ERK5 e PKM2

   I ricercatori desiderano analizzare l'espressione di ERK5 e PKM2 mediante RT-qPCR per studiare il trascrittoma a livello di RNA e mediante Western Blot ed ELISA per studiare le forme fosforilate e totali delle due chinasi.

   RT-qPCR richiede l'estrazione dell'RNA, la trascrizione inversa in cDNA e quindi l'amplificazione dei geni che codificano ERK5 e PKM2 utilizzando primer specifici progettati in precedenza. I risultati saranno confrontati con quelli ottenuti con primers del gene HPRT.

2. / Studio dell'equilibrio tra azione pro e antinfiammatoria

   I ricercatori desiderano caratterizzare l'equilibrio dell'attività pro e antinfiammatoria studiando la fenotipizzazione dei linfociti e determinando il livello delle citochine.

   La fenotipizzazione dei linfociti sarà eseguita mediante citometria a flusso da PBMC. Le popolazioni studiate includeranno le popolazioni Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, Treg e TFH.

   Il pannello delle citochine principalmente infiammatorie sarà studiato nel plasma e nel CSF mediante ELISA. Il pannello include le seguenti citochine: IL17, TNF, IL6, Il 1β, IL 10, IL33, IL12, IL 23

3. / Analisi del metabolismo

   I database sui metabolomi umani includono più di 40.000 metaboliti e consentono la creazione di profili metabolici in diversi contesti patologici mediante tecniche di analisi statistica supervisionata e non supervisionata. Le analisi del metabolismo saranno eseguite da plasma e CSF. Queste analisi saranno effettuate mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa (LC-MS) dalla rete Metabohub (MetaboHUB-Clermont per le analisi del plasma e MetaboHUB-Saclay per le analisi del CSF).

4. / Misura della catena leggera del neurofilamento (NfL)

C'è un crescente interesse per la misura dei neurofilamenti nel sangue e in particolare nel CSF. Alti livelli di neurofilamenti sono la prova della perdita neuronale, indipendentemente dal meccanismo iniziale. La catena leggera del neurofilamento (NfL) sembra essere la forma più rilevante per misurare la perdita assonale. Nella SM, è stato osservato un aumento di NfL durante i primi due mesi di recidiva acuta. Al contrario, ci sono pochi dati sulla cinetica dei livelli di NfL nelle malattie demielinizzanti periferiche.

I ricercatori intendono studiare i livelli di NfL nel sangue e nel liquido cerebrospinale per determinare se vi è un aumento dei livelli di NfL nei pazienti seguiti per GBS e confrontare i livelli di NfL di questi pazienti (gruppo 3) con i pazienti seguiti per SM (gruppo 2).