Perfil de expresión de las quinasas ERK5 y PKM2 en enfermedades neuroinflamatorias. (NEUROKINASE)

Se evaluará el estudio de la expresión de las cinasas ERK5 y PKM2 en pacientes seguidos por EM RR o SGB, al inicio de la patología.

Se realizará el estudio de diagnóstico habitual para MS y GBS para clasificar a los pacientes en 4 grupos:

• Grupo 1: grupo de control. Pacientes que no cumplen criterios de EM o SGB y en los que no se ha realizado diagnóstico diferencial.

Los subgrupos 1a y 1b se formarán por emparejamiento respectivo con los grupos 2 y 3.

• Grupo 2: pacientes con EM RR confirmada por los criterios de Macdonald (2017)
• Grupo 3: pacientes con SGB confirmado por la asociación de los signos clínicos y electrofisiológicos habituales.
• Grupo 4: pacientes en los que se ha identificado un diagnóstico diferencial para explicar los síntomas. Estos pacientes serán excluidos del análisis.

Se tomará una muestra de sangre adicional (25 ml) y una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) (2 ml) de todos los pacientes para estudiar los parámetros de laboratorio de este estudio. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y los neutrófilos se aislarán de la sangre mediante un gradiente de Percoll. Las muestras del grupo 4 no se analizarán.

El análisis se centrará en la comparación de parámetros de laboratorio entre el grupo 2 y 3, entre el grupo 1a y 2, y entre el 1b y 3.

1. / Expresión de quinasas ERK5 y PKM2

   Los investigadores desean analizar la expresión de ERK5 y PKM2 mediante RT-qPCR para investigar el transcriptoma a nivel de ARN y mediante Western Blot y ELISA para investigar las formas fosforiladas y totales de las dos quinasas.

   RT-qPCR requiere la extracción de ARN, la transcripción inversa en ADNc y luego la amplificación de los genes que codifican ERK5 y PKM2 utilizando cebadores específicos diseñados de antemano. Los resultados se compararán con los obtenidos con cebadores del gen HPRT.

2. / Estudio del equilibrio entre la acción pro y antiinflamatoria

   Los investigadores desean caracterizar el equilibrio de la actividad proinflamatoria y antiinflamatoria mediante el estudio del fenotipo de los linfocitos y la determinación del nivel de citocinas.

   El fenotipado de linfocitos se realizará mediante citometría de flujo de PBMC. Las poblaciones estudiadas incluirán las poblaciones Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, Treg y TFH.

   El panel de citocinas principalmente inflamatorias se estudiará en plasma y en LCR mediante ELISA. El panel incluye las siguientes citoquinas: IL17, TNF, IL6, Il 1β, IL 10, IL33, IL12, IL 23

3. / Análisis del metaboloma

   Las bases de datos sobre metabolomas humanos incluyen más de 40.000 metabolitos y permiten establecer perfiles metabólicos en diferentes contextos patológicos mediante técnicas de análisis estadístico supervisadas y no supervisadas. Los análisis de metaboloma se realizarán a partir de plasma y LCR. Estos análisis se realizarán mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) por la red Metabohub (MetaboHUB-Clermont para análisis de plasma y MetaboHUB-Saclay para análisis de LCR).

4. / Medida de la cadena ligera del neurofilamento (NfL)

Existe un interés creciente en la medida de los neurofilamentos en la sangre y en particular en el LCR. Los altos niveles de neurofilamentos son evidencia de pérdida neuronal, independientemente del mecanismo inicial. La cadena ligera de neurofilamento (NfL) parece ser la forma más relevante para medir la pérdida axonal. En la EM, se observó un aumento de NfL durante los dos primeros meses de la recaída aguda. Por el contrario, hay pocos datos sobre la cinética de los niveles de NfL en enfermedades desmielinizantes periféricas.

Los investigadores pretenden estudiar los niveles de NfL en sangre y LCR para determinar si hay un aumento en los niveles de NfL en pacientes seguidos por SGB y comparar los niveles de NfL de estos pacientes (grupo 3) con pacientes seguidos por EM (grupo 2).