体外受精の妊娠結果に対する不妊治療薬とコエンザイムQ10の効果 (CoQ10-IVF)

この研究の目的は、卵母細胞の異数性率および累積生児出生率に対する影響に関して、CoQ10投与の有効性を評価することです。

研究デザイン これは前向きランダム化プラセボ対照研究です。 研究参加者は、このプロトコルの一部として最大 3 サイクルを受けます。 すべての臨床評価は、参加している不妊クリニックで実施されます。

この研究は、トロント高度生殖技術センター（TCART）で外来ベースで組織されます。 この研究には、体外受精治療を受けている 35 ～ 43 歳の女性 54 人が参加します。 すべての女性は、arNOX アッセイ (後述) による coQ10 活性のベースライン測定のために、5 mL ポリエチレンチューブに 2 mL の唾液を採取します。

研究参加者は、プラセボまたは COQ10 カプセルのいずれかにランダムに割り当てられます (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD 登録コード 135307)。 研究参加者は、体外受精サイクルの 2 か月前から 1 日 1 回、朝食または同一のプラセボ カプセルと一緒に 600 mg の CoQ10 を経口摂取し、妊娠しない場合は最大 3 サイクル摂取します。 サイクル3日目に、被験者はサプリメントの摂取を続けながら、体外受精のために卵巣刺激を開始します。 制御された卵巣刺激 (COH) は、マイクロドーズ GnRH アゴニスト フレア プロトコルで構成されます。これは、年配の女性のためのクリニックの標準プロトコルです。 COHは、組換えFSH（Puregon; Schering-Plough Inc.、Mississauga、ON、Canada）またはヒト更年期ゴナドトロピン（Menopur、Ferring Inc、Oakville、ON、Canada）1日2回150ユニットを使用して行われます。 -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0.05 mg を B.I.D 皮下投与し、10,000 単位のヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG) (Pregnyl, Organon) の前日まで継続します。 投与量は変更されず、研究期間中維持する必要があります。 両方の薬剤は、卵胞の発育が適切であると見なされるまで (少なくとも 3 つの卵胞が 17 mm を超え、存在する卵胞の数に対して E2 レベルが許容可能である)、最終的な卵胞の成熟を引き起こすために hCG が注射されるまで、毎日続けられます。 卵母細胞の回収は、36時間後に膣超音波誘導針吸引により、局所麻酔と軽度の鎮静を使用して行われます。 回収時に、被験者は2 mLの唾液を収集します。さらに、arNOXアッセイによるcoQ10活性の決定のために、各卵巣から吸引された最初の卵胞から2 mLの卵胞液が収集されます。 単一細胞の CoQ10 レベルを測定することはできません (例: 卵母細胞)、FF は、この細胞の代謝プロファイルを反映できる直接的な細胞環境を表します。 回収後、極体生検サンプル中に精子DNAで母体DNAを汚染しないように、卵母細胞をICSIで受精させます。 翌日、2 つの前核を持つすべての卵母細胞は、一方または両方の極体の生検を受けます。

極体生検 次に、細胞質内精子注入法 (ICSI) 技術を使用して卵母細胞を受精させ、インキュベーターで培養します。 極体を生検するために、卵母細胞を保持ピペットで保持し、極体を 11 ～ 12 時の位置にします。 透明帯に開口部が作られ、磨かれたガラス針が囲卵腔に導入され、極体が慎重に取り除かれる。

胚移植は、採卵後3日目の朝に行います。

極体を等張 HEPES 緩衝生理食塩水の液滴で洗浄した後、低張溶液に移し、メタノールで固定: ガラス スライド上の酢酸、さらに遺伝子分析のためにメタノールで脱水します。 極体は上記のプロセスに関与していないため、手順全体が生検卵母細胞の受精率または卵割率に悪影響を与えることはありません。

極体は、染色体数の決定のために UHN マイクロアレイ センターに転送されます。 分析は、Advalytix (Olympus Life Science Research、ミュンヘン、ドイツ) の市販キットを使用して行います。 これはマルチプレックス PCR ベースのキットで、23 本の染色体すべてを迅速かつ正確にカウントし、極体染色体カウントに合わせて調整されています。 2日後、正常な核型を有する単一の胚を、クック移植カテーテル（クック、シドニー、オーストラリア）を使用して超音波ガイド下で子宮腔に移植する。 正常な核型を持つ生存可能な残りの胚は凍結されます (低速凍結)。 黄体サポートは、プロゲステロン座薬100mg（Kingsway Pharmacy、Toronto、Ontario Canada）で構成され、転送日から1日3回経膣投与され、血清ベータhCGが採取され、妊娠している場合は、各サイクルの終わりまで2週間続きます、CoQ10/プラセボは中止されます。 妊娠している場合、黄体サポートは妊娠10週まで続きます。 患者が妊娠していない場合、十分な子宮内膜の厚さが測定されたら、微粉化エストラジオールによる子宮内膜刺激のサイクルがあり、続いてプロゲステロンが続きます。 4日後、1～2個の胚を解凍して移植します。 黄体サポートにはエストラジオールとプロゲステロンが含まれ、妊娠している場合は最大 10 週間維持されます。 凍結胚移植のこれらのサイクルは、同じ検索からの凍結胚がある限り継続されます。

試験のエンドポイントは次のとおりです。

1. 一次結果の尺度は、回収ごとの正倍数体卵の数とパーセンテージになります

2. 二次結果の測定には以下が含まれます。

   • 卵巣反応
   • 胚の質
   • 累計妊娠率・回収率
   • 累積出生率・検索
   • arNOXアッセイによる唾液および卵胞液中のCoQ10活性

コエンザイム Q10 アッセイ arNOX は、コエンザイム Q10 によって阻害される老化に関連する細胞表面の外部 NADH オキシダーゼ (ECTO-NOX) タンパク質で、血清や唾液にも存在します。 これは、フェリシトクロム c (酸化シトクロム C) のスーパーオキシドジスムターゼ阻害還元として測定されるスーパーオキシド生成が可能です。高齢者の唾液のarNOX活性は、コエンザイムQ10によって阻害されます。 この活動は 30 歳以降に初めて現れ、55 歳頃にほぼ最大になります。

arNOX 活性は、スーパーオキシドによるフェリシトクロム c の還元が 540 nm での基準で 550 nm での吸光度の増加から監視される標準的な方法に基づくスーパーオキシド生成の測定からアッセイされます。 arNOX 活性の特異性をさらにチェックするために、アッセイの終わり近くにスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) を添加して、レートがベースラインに戻ったことを確認します。 このアッセイは、150 μl (2 mg/ml) の酸化フェリシトクロム c 溶液と 200 μl の唾液を 2.5 ml のアッセイバッファー (8.06 g NaCl、0.2 g KCl、0.18 g Na 2HPO4、0.26 g KH2PO4、0.13 g CaCl2、0.1 g MgCl2、1.35 g のグルコースを 1000 ml の脱イオン水に溶解し、pH 7.4 に調整し、ろ過して 4℃で保存します)。 速度は、連続測定 (1.5 分ごとに 1 分以上) で二重波長モードの分光光度計を使用して決定されます。 ４５分後、６０μｌ（６０単位含有）のＳＯＤを添加し、アッセイをさらに４５分間続ける。

唾液arNOXは、臨床コエンザイムQ10介入試験でarNOXレベルを監視する便利で非侵襲的な方法であり、応答レベルは血清および細胞arNOXで見られるものと同等であることがわかりました（Morre and Morre 2008）.

調査対象母集団

妊娠を希望する合計54人の女性患者が、TCART-トロント高度生殖技術センターでのこの研究に登録されます。 各被験者は、研究の包含および除外基準を満たす必要があります

電力計算:

合計 54 人の患者が、この 2 つの治療の並行デザイン試験に参加します。 異数性率の治療間の真の差が 25% である場合、研究が p 値 ≤ 0.01 の両側で治療差を検出する確率は 90% です。 これは、応答変数の標準偏差が 0.180 であるという仮定に基づいています。

治療への割り当てと無作為化:

患者は、研究登録の日に年代順に割り当てられ、コンピューターで生成された無作為化に割り当てられます。 登録された各参加者は、研究期間中、プラセボまたはCoQ10のいずれかを含む事前に割り当てられたパッケージを受け取ります. 医師は、患者の割り当てに関して盲検化されます。 無作為化は、最初のサイクルを開始する前に行われます。

捜査官は、必要に応じて被験者ファイルのデータを簡単にチェックできるように、被験者の名前とコード番号を関連付けた別の記録を保持します。

統計分析は、スチューデント t 検定を使用して、すべての結果測定について治療群とプラセボ群の間で比較します。 検出力分析は、アルファ < 0.01 に対して計算されました。

予想される結果と潜在的な落とし穴。 研究に必要な患者数は合理的であり、それが障害になるとは考えていません。 この研究の結果が動物研究にある場合、試験群と対照群の間の正倍数体胚の数、およびその他の結果パラメーターに有意差を示すことができるはずです. 現在非常にうまく機能している Advalytics マルチプレックス PCR キットの使用を最適化するために、UHN マイクロアレイ ラボと数か月間協力してきました。 オブジェクトのこのコンポーネントに問題はないと予想されます。