Wpływ koenzymu Q10 wraz z lekami wspomagającymi płodność na przebieg ciąży po zapłodnieniu in vitro (CoQ10-IVF)

Celem tego badania jest ocena skuteczności podawania CoQ10 w odniesieniu do jego wpływu na szybkość aneuploidii oocytów i skumulowany wskaźnik żywych urodzeń.

Projekt badania Jest to prospektywne, randomizowane badanie kontrolowane placebo. W ramach tego protokołu uczestnicy badania zostaną poddani aż 3 cyklom. Wszystkie oceny kliniczne zostaną przeprowadzone w uczestniczących klinikach leczenia niepłodności.

Badanie zostanie zorganizowane w trybie ambulatoryjnym w Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology (TCART). Badaniem zostaną objęte 54 kobiety w wieku 35-43 lata poddawane zabiegowi IVF. Wszystkie kobiety pobiorą 2 ml śliny do polietylenowej probówki o pojemności 5 ml w celu podstawowego pomiaru aktywności coQ10 za pomocą testu arNOX (opisanego poniżej).

Uczestnicy badania zostaną losowo przydzieleni do kapsułek placebo lub COQ10 (AOR – Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, kody rejestracyjne NHPD 135307). Uczestnicy badania będą przyjmować doustnie 600 mg CoQ10 raz dziennie ze śniadaniem lub identyczne kapsułki placebo przez 2 miesiące przed cyklem zapłodnienia in vitro i do 3 cykli, jeśli ciąża nie wystąpi. W 3. dniu cyklu pacjentki rozpoczną stymulację jajników w celu zapłodnienia in vitro, kontynuując jednocześnie przyjmowanie suplementów. Kontrolowana stymulacja jajników (COH) będzie składać się z protokołu błysku agonisty GnRH w mikrodawkach, który jest standardowym protokołem kliniki dla starszych kobiet. COH zostanie wykonane przy użyciu rekombinowanego FSH (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Kanada) lub ludzkich gonadotropin menopauzalnych (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Kanada) 150 jednostek dwa razy dziennie S.C. i Buserelin Acetate (Superfact, Sanofi -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg podskórnie dwa razy na dobę i będzie kontynuowane do dnia poprzedzającego podanie 10 000 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) (Pregnyl, Organon). Dawka nie zostanie zmieniona i musi być utrzymana przez cały czas trwania badania. Oba leki będą podawane codziennie, aż rozwój pęcherzyków zostanie uznany za odpowiedni (co najmniej 3 pęcherzyki >17 mm, a poziom E2 jest akceptowalny dla liczby obecnych pęcherzyków), kiedy to zostanie wstrzyknięta hCG w celu wywołania ostatecznego dojrzewania pęcherzyków. Pobranie oocytów zostanie przeprowadzone 36 godzin później przez aspirację igłą pod kontrolą USG pochwy oraz przy zastosowaniu znieczulenia miejscowego i łagodnej sedacji. Podczas pobierania pacjentki pobiorą 2 ml śliny, ponadto z pierwszego pęcherzyka aspirowanego z każdego jajnika zostaną pobrane 2 ml płynu pęcherzykowego w celu określenia aktywności coQ10 za pomocą testu arNOX. Ponieważ nie jest możliwe zmierzenie poziomu CoQ10 w pojedynczych komórkach (np. oocytów), FF reprezentuje bezpośrednie środowisko komórkowe, które może odzwierciedlać profil metaboliczny tej komórki. Po pobraniu oocyty zostaną zapłodnione metodą ICSI, aby podczas biopsji ciałka kierunkowego DNA plemników nie zanieczyścić matczynego DNA. Następnego dnia wszystkie komórki jajowe z 2 przedjądrzami zostaną poddane biopsji jednego lub obu ciałek kierunkowych.

Biopsja ciałka kierunkowego Oocyt jest następnie inseminowany techniką docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemnika (ICSI) i hodowany w inkubatorze. W celu wykonania biopsji ciałka kierunkowego, oocyt jest przytrzymywany przez pipetę podtrzymującą z ciałkiem kierunkowym w pozycji na godzinie 11-12. W strefie przezroczystej wykonuje się otwór i wprowadza się igłę z polerowanego szkła do przestrzeni okołowitelilinowej i ostrożnie usuwa ciałko kierunkowe.

Transfer zarodków odbywa się rano trzeciego dnia po pobraniu komórki jajowej.

Ciała polarne przemywa się kropelkami izotonicznej soli fizjologicznej buforowanej HEPES, a następnie przenosi do roztworu hipotonicznego, utrwala w metanolu: kwasie octowym na szkiełku i odwadnia w metanolu do dalszej analizy genetycznej. Cała procedura nie wpływa niekorzystnie ani na zapłodnienie, ani na tempo rozszczepiania biopsji oocytów, ponieważ ciałko kierunkowe nie bierze udziału w powyższych procesach.Kariotypowanie:

Ciała polarne zostaną przeniesione do centrum mikromacierzy UHN w celu określenia liczby chromosomów. Analiza zostanie przeprowadzona za pomocą komercyjnego zestawu firmy Advalytix (Olympus Life Science Research, Monachium, Niemcy). Jest to zestaw oparty na multipleksowym PCR, który zapewnia szybkie i dokładne zliczenie wszystkich 23 chromosomów i jest dostosowany do liczby chromosomów ciała polarnego. Po 2 dniach pojedynczy zarodek z prawidłowym kariotypem zostanie przeniesiony do jamy macicy pod kontrolą USG za pomocą cewnika do transferu Cooka (Cook, Sidney, Australia). Pozostałe zdolne do życia zarodki z prawidłowym kariotypem zostaną zamrożone (powolne zamrażanie). Wspomaganie lutealne będzie polegać na czopkach progesteronowych 100 mg (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario, Kanada) dopochwowo 3 razy dziennie, począwszy od dnia transferu i będzie kontynuowane przez 2 tygodnie do końca każdego cyklu, kiedy zostanie pobrane beta hCG w surowicy i jeśli ciąża , CoQ10/placebo zostanie wycofane. W przypadku ciąży wspomaganie fazy lutealnej będzie kontynuowane do 10 tygodnia ciąży. Jeśli pacjentka nie jest w ciąży, zostanie poddana cyklowi stymulacji endometrium mikronizowanym estradiolem, a następnie progesteronem po zmierzeniu wystarczającej grubości endometrium. Cztery dni później 1-2 zarodki zostaną rozmrożone i przeniesione. Wsparcie lutealne będzie obejmować estradiol i progesteron, które będą utrzymywane do 10 tygodni w przypadku ciąży. Te cykle transferu zamrożonych zarodków będą kontynuowane tak długo, jak długo będą dostępne zamrożone zarodki z tego samego pobrania.

Punktami końcowymi badania będą:

1. Podstawową miarą wyniku będzie liczba i odsetek jaj euploidalnych na pobranie

2. Miary wyniku drugorzędnego obejmują:

   • Odpowiedź jajników
   • Jakość zarodka
   • Skumulowany wskaźnik ciąż/odzysk
   • Skumulowany wskaźnik żywych urodzeń / odzyskiwanie
   • Aktywność CoQ10 w ślinie i płynie pęcherzykowym w teście arNOX

Test koenzymu Q10 arNOX jest hamowanym przez koenzym Q10, związanym ze starzeniem białkiem zewnętrznej oksydazy NADH (ECTO-NOX) na powierzchni komórki, obecnym również w surowicach i ślinie. Jest zdolny do wytwarzania ponadtlenku mierzonego jako hamowana przez dysmutazę ponadtlenkową redukcja ferrycytochromu c (utleniony cytochrom C). Aktywność arNOX śliny osób starszych jest hamowana przez koenzym Q10. Aktywność pojawia się po raz pierwszy po 30 roku życia do prawie maksimum w wieku około 55 lat.

Aktywność arNOX oznacza się na podstawie pomiarów wytwarzania nadtlenku w oparciu o standardową metodę, w której redukcja ferrycytochromu c nadtlenkiem jest monitorowana na podstawie wzrostu absorbancji przy 550 nm z odniesieniem przy 540 nm. Jako dalsze sprawdzenie specyficzności aktywności arNOX, pod koniec testu dodaje się dysmutazę ponadtlenkową (SOD), aby upewnić się, że szybkość powróciła do linii podstawowej. Test składa się z 150 μl (2 mg/ml) roztworu utlenionego żelazocytochromu c i 200 μl śliny dodanych do 2,5 ml buforu testowego (8,06 g NaCl, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g KH2PO4, 0,13 g CaCl2, 0,1 g g MgCl2, 1,35 g glukozy rozpuszczonej w 1000 ml wody dejonizowanej, doprowadzonej do pH 7,4, przefiltrowanej i przechowywanej w 4°C). Szybkości określa się za pomocą spektrofotometru w trybie podwójnej długości fali z pomiarami ciągłymi (ponad 1 min co 1,5 min). Po 45 minutach dodaje się 60 µl (zawierającego 60 jednostek) SOD i kontynuuje oznaczenie przez dodatkowe 45 minut.

Stwierdzono, że ślinowy arNOX jest wygodną i nieinwazyjną metodą monitorowania poziomów arNOX w klinicznych badaniach interwencyjnych koenzymu Q10 z poziomami odpowiedzi podobnymi do tych obserwowanych w surowicy i komórkowym arNOX (Morre i Morre 2008).

Badana populacja

W sumie 54 pacjentki pragnące ciąży zostaną włączone do tego badania w TCART-Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology. Każdy przedmiot musi spełniać kryteria włączenia i wyłączenia z badania

Obliczenie mocy:

Łącznie 54 pacjentów weźmie udział w tym równoległym badaniu obejmującym dwa rodzaje leczenia. Prawdopodobieństwo, że badanie wykryje różnicę w leczeniu dwustronnym z wartością p ≤ 0,01, wynosi 90 procent, jeśli rzeczywista różnica między leczeniami we wskaźniku aneuploidii wynosi 25%. Opiera się to na założeniu, że odchylenie standardowe zmiennej odpowiedzi wynosi 0,180.

Przydział do leczenia i randomizacja:

Pacjenci zostaną przydzieleni w porządku chronologicznym w dniu włączenia do badania do wygenerowanej komputerowo randomizacji. Każdy zarejestrowany uczestnik otrzyma wstępnie przydzielony pakiet zawierający placebo lub CoQ10 na czas trwania badania. Lekarz będzie zaślepiony, jeśli chodzi o przydział pacjentów. Randomizacja zostanie przeprowadzona przed rozpoczęciem pierwszego cyklu.

Śledczy będą prowadzić osobny rejestr odnoszący się do nazwisk osób badanych i ich numerów kodowych, aby w razie potrzeby umożliwić łatwe sprawdzenie danych w aktach podmiotów.

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona za pomocą testu t-studenta do obozowicza między grupą leczoną a grupą placebo dla wszystkich miar wyników. Analiza mocy została obliczona dla alfa < 0,01.

Przewidywane wyniki i potencjalne pułapki. Liczba pacjentów potrzebnych do badania jest rozsądna i nie spodziewamy się, aby stanowiła przeszkodę. Jeśli wyniki tego badania będą zgodne z badaniami na zwierzętach, powinniśmy być w stanie wykazać istotną różnicę w liczbie zarodków euploidalnych między grupą badaną i kontrolną, a także w innych parametrach wyników. Od kilku miesięcy współpracujemy z laboratorium mikromacierzy UHN nad optymalizacją wykorzystania zestawu multipleksowego PCR firmy Advalytics, który obecnie sprawdza się bardzo dobrze. Nie przewidujemy żadnych problemów z tym elementem obiektu.