L'effetto del coenzima Q10 insieme ai farmaci per la fertilità sull'esito della gravidanza della fecondazione in vitro (CoQ10-IVF)

L'obiettivo di questo studio è valutare l'efficacia della somministrazione di CoQ10 rispetto al suo effetto sul tasso di aneuploidia degli ovociti e sul tasso cumulativo di nati vivi.

Disegno dello studio Questo è uno studio prospettico randomizzato controllato con placebo. I partecipanti allo studio saranno sottoposti a fino a 3 cicli come parte di questo protocollo. Tutte le valutazioni cliniche saranno condotte presso le cliniche per l'infertilità partecipanti.

Lo studio sarà organizzato su base ambulatoriale presso il Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology (TCART). Lo studio coinvolgerà 54 donne di età compresa tra 35 e 43 anni sottoposte a trattamento di fecondazione in vitro. Tutte le donne raccoglieranno 2 ml di saliva in un tubo di polietilene da 5 ml per la misurazione di base dell'attività del coQ10 mediante il test arNOX (descritto di seguito).

I partecipanti allo studio saranno assegnati in modo casuale a capsule placebo o COQ10, (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, codici di registrazione NHPD 135307). I partecipanti allo studio assumeranno 600 mg di CoQ10 per via orale una volta al giorno con la colazione o capsule placebo identiche per 2 mesi prima di un ciclo di fecondazione in vitro e fino a 3 cicli se la gravidanza non si verifica. Il giorno 3 del ciclo, i soggetti inizieranno la stimolazione ovarica per la fecondazione in vitro continuando il consumo degli integratori. La stimolazione ovarica controllata (COH) consisterà nel protocollo flare agonista del GnRH a microdosi, che è il protocollo standard della clinica per le donne anziane. La COH verrà eseguita utilizzando FSH ricombinante (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Canada) o gonadotropine umane della menopausa (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Canada) 150 unità S.C. due volte al giorno e Buserelin Acetate (Superfact, Sanofi -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg per via sottocutanea B.I.D e continuerà fino al giorno precedente a 10.000 unità di gonadotropina corionica umana (hCG) (Pregnyl, Organon). Il dosaggio non verrà modificato e dovrà essere mantenuto per tutta la durata dello studio. Entrambi i farmaci continueranno quotidianamente fino a quando lo sviluppo follicolare non sarà considerato adeguato (almeno 3 follicoli> 17 mm e il livello E2 è accettabile per il numero di follicoli presenti) a quel punto verrà iniettato l'hCG per innescare la maturazione follicolare finale. Il prelievo degli ovociti verrà effettuato 36 ore dopo mediante agoaspirazione vaginale ecoguidata e con l'uso di anestesia locale e lieve sedazione. Al momento del recupero, i soggetti raccoglieranno 2 mL di saliva, inoltre, 2 mL di liquido follicolare saranno raccolti dal primo follicolo aspirato da ciascuna ovaia per la determinazione dell'attività del coQ10 mediante il test arNOX. Poiché non è possibile misurare i livelli di CoQ10 in una singola cellula (ad es. ovociti), FF rappresenta l'ambiente cellulare diretto che può riflettere il profilo metabolico di questa cellula. Dopo il prelievo, gli ovociti saranno fecondati con ICSI per non contaminare il DNA materno durante la biopsia del corpo polare con il DNA dello sperma. Il giorno seguente tutti gli ovociti con 2 pronuclei verranno sottoposti a biopsia di uno o entrambi i corpi polari.

Biopsia del corpo polare L'ovocita viene quindi inseminato utilizzando la tecnica dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) e conservato in coltura in un'incubatrice. Per eseguire la biopsia del corpo polare, l'ovocita viene trattenuto dalla pipetta con il corpo polare nella posizione a ore 11-12. Viene praticata un'apertura nella zona pellucida e un ago di vetro levigato viene introdotto nello spazio perivitellino e il corpo polare viene accuratamente rimosso.

Il trasferimento dell'embrione viene eseguito la mattina del terzo giorno dopo il prelievo degli ovuli.

I corpi polari vengono lavati in goccioline di soluzione salina isotonica tamponata con HEPES e quindi trasferiti in una soluzione ipotonica, fissata in metanolo: acido acetico su un vetrino e disidratati in metanolo per ulteriori analisi genetiche. L'intera procedura non influisce negativamente né sulla fecondazione né sui tassi di scissione negli ovociti sottoposti a biopsia, poiché il corpo polare non è coinvolto nei processi di cui sopra. Cariotipo:

I corpi polari saranno trasferiti al centro microarray UHN per la determinazione del numero cromosomico. L'analisi sarà effettuata con un kit commerciale di Advalytix (Olympus Life Science Research, Monaco, Germania). Questo è un kit basato su PCR multiplex che fornisce un conteggio rapido e accurato di tutti i 23 cromosomi ed è adattato al conteggio dei cromosomi del corpo polare. Dopo 2 giorni un singolo embrione con un cariotipo normale verrà trasferito nella cavità uterina sotto guida ecografica utilizzando un catetere di trasferimento Cook (Cook, Sidney, Australia). Il resto degli embrioni vitali con un cariotipo normale verrà congelato (congelamento lento). Il supporto luteale consisterà in supposte di progesterone da 100 mg (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario Canada) per via vaginale 3 volte al giorno a partire dal giorno del trasferimento e continuerà per 2 settimane fino alla fine di ogni ciclo quando verrà prelevato il siero beta hCG e in caso di gravidanza , CoQ10/placebo sarà interrotto. In caso di gravidanza, il supporto luteale continuerà fino alla 10a settimana di gestazione. Se la paziente non è gravida verrà sottoposta a un ciclo di stimolazione endometriale con estradiolo micronizzato, seguito da progesterone una volta misurato uno spessore endometriale sufficiente. Quattro giorni dopo, 1-2 embrioni saranno scongelati e trasferiti. Il supporto luteale includerà estradiolo e progesterone che saranno mantenuti fino a 10 settimane in caso di gravidanza. Questi cicli di trasferimento di embrioni congelati continueranno finché ci saranno embrioni congelati dallo stesso prelievo.

Gli endpoint dello studio saranno:

1. La misura dell'esito primario sarà il numero e la percentuale di uova euploidi per recupero

2. Le misure di outcome secondari includeranno:

   • Risposta ovarica
   • Qualità dell'embrione
   • Tasso cumulativo di gravidanza/recupero
   • Tasso cumulativo di nati vivi/recupero
   • Attività del CoQ10 nella saliva e nel liquido follicolare mediante dosaggio di arNOX

Saggio del coenzima Q10 arNOX è una proteina NADH ossidasi esterna correlata all'invecchiamento (ECTO-NOX) della superficie cellulare, inibita dal coenzima Q10, che è presente anche nel siero e nella saliva. È in grado di generare superossido misurato come riduzione inibita dalla superossido dismutasi del ferricitocromo c (citocromo C ossidato). L'attività arNOX della saliva degli individui più anziani è inibita dal coenzima Q10. L'attività appare per la prima volta dopo i 30 anni fino a un massimo vicino a circa 55 anni.

L'attività di arNOX viene analizzata dalle misurazioni della produzione di superossido basate sul metodo standard in cui la riduzione del ferricitocromo c da parte del superossido viene monitorata dall'aumento dell'assorbanza a 550 nm con riferimento a 540 nm. Come ulteriore controllo della specificità dell'attività di arNOX, la superossido dismutasi (SOD) viene aggiunta verso la fine del dosaggio per accertare che il tasso sia tornato alla linea di base. Il test consiste in 150 μl (2 mg/ml) di soluzione di ferricitocromo c ossidato e 200 μl di saliva aggiunti a 2,5 ml di tampone del test (8,06 g NaC1, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g KH2PO4, 0,13 g CaCl2, 0,1 g MgCl2, 1,35 g di glucosio sciolti in 1000 ml di acqua deionizzata, regolata a pH 7,4, filtrata e conservata a 4◦C). I tassi sono determinati utilizzando uno spettrofotometro nella modalità a doppia lunghezza d'onda con misurazioni continue (oltre 1 min ogni 1,5 min). Dopo 45 min, vengono aggiunti 60 μl (contenenti 60 unità) di SOD e il test viene continuato per altri 45 min.

L'arNOX salivare è risultato essere un metodo conveniente e non invasivo per monitorare i livelli di arNOX negli studi clinici di intervento del coenzima Q10 con livelli di risposta paralleli a quelli osservati con l'arNOX sierico e cellulare (Morre e Morre 2008).

Popolazione di studio

Un totale di 54 pazienti di sesso femminile che desiderano una gravidanza saranno arruolate in questo studio presso il TCART- Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology. Ogni soggetto deve soddisfare i criteri di inclusione ed esclusione dallo studio

Calcolo della potenza:

Un totale di 54 pazienti parteciperanno a questo studio di progettazione parallela a due trattamenti. La probabilità è del 90% che lo studio rilevi una differenza di trattamento a due code con p-value ≤ 0,01, se la vera differenza tra i trattamenti nel tasso di aneuploidia è del 25%. Questo si basa sul presupposto che la deviazione standard della variabile di risposta sia 0,180.

Assegnazione al trattamento e randomizzazione:

I pazienti verranno assegnati in ordine cronologico il giorno dell'arruolamento nello studio a una randomizzazione generata dal computer. Ciascun partecipante iscritto riceverà un pacchetto preassegnato contenente placebo o CoQ10 per la durata dello studio. Il medico sarà cieco per quanto riguarda l'assegnazione dei pazienti. La randomizzazione verrà effettuata prima dell'inizio del primo ciclo.

Gli investigatori manterranno una registrazione separata relativa ai nomi dei soggetti ai loro numeri di codice, per consentire un facile controllo dei dati nei file dei soggetti quando richiesto.

L'analisi statistica verrà eseguita con il test t dello studente al camper tra il trattamento e il gruppo placebo per tutte le misure di esito. L'analisi della potenza è stata calcolata per alfa <0,01.

Risultati previsti e potenziali insidie. Il numero di pazienti necessari per lo studio è ragionevole e non ci aspettiamo che sia un ostacolo. Se i risultati di questo studio corrisponderanno allo studio sugli animali, dovremmo essere in grado di mostrare una differenza significativa nel numero di embrioni euploidi tra il test e il gruppo di controllo, nonché con gli altri parametri di esito. Stiamo lavorando da diversi mesi con il laboratorio di microarray UHN per ottimizzare l'uso del kit Advalytics multiplex PCR che attualmente funziona molto bene. Non prevediamo alcun problema con questo componente dell'oggetto.