Влияние коэнзима Q10 вместе с препаратами для лечения бесплодия на исход беременности при экстракорпоральном оплодотворении (CoQ10-IVF)

Целью данного исследования является оценка эффективности введения CoQ10 в отношении его влияния на скорость анеуплоидии ооцитов и кумулятивную частоту живорождения.

Дизайн исследования Это проспективное рандомизированное плацебо-контролируемое исследование. Участники исследования пройдут до 3 циклов в рамках этого протокола. Все клинические оценки будут проводиться в участвующих клиниках по лечению бесплодия.

Исследование будет организовано амбулаторно в Центре передовых репродуктивных технологий Торонто (TCART). В исследовании примут участие 54 женщины в возрасте 35-43 лет, проходящие курс ЭКО. У всех женщин будет взято 2 мл слюны в полиэтиленовую пробирку объемом 5 мл для базового измерения активности coQ10 с помощью анализа arNOX (описано ниже).

Участникам исследования будет случайным образом назначено либо плацебо, либо капсулы COQ10 (AOR - Advanced Orthoatomic Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, регистрационные коды NHPD 135307). Участники исследования будут принимать 600 мг CoQ10 перорально один раз в день во время завтрака или идентичные капсулы плацебо в течение 2 месяцев до цикла ЭКО и до 3 циклов, если беременность не наступит. На 3-й день цикла испытуемые начнут стимуляцию яичников для экстракорпорального оплодотворения, продолжая принимать добавки. Контролируемая стимуляция яичников (COH) будет состоять из протокола вспышки микродоз агониста GnRH, который является стандартным протоколом клиники для пожилых женщин. КГЯ будет проводиться с использованием рекомбинантного ФСГ (Puregon; Schering-Plough Inc., Миссиссауга, Онтарио, Канада) или менопаузальных гонадотропинов человека (Menopur, Ferring Inc., Оквилл, Онтарио, Канада) по 150 единиц два раза в день подкожно и ацетат бусерелина (Superfact, Sanofi). -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 мг подкожно два раза в день и будет продолжаться до дня, предшествующего 10 000 единиц хорионического гонадотропина человека (hCG) (Pregnyl, Organon). Дозировка не будет изменена и должна сохраняться на протяжении всего исследования. Оба препарата будут принимать ежедневно до тех пор, пока развитие фолликулов не будет считаться адекватным (по крайней мере, 3 фолликула > 17 мм, а уровень E2 является приемлемым для количества присутствующих фолликулов), после чего будет введен ХГЧ, чтобы вызвать окончательное созревание фолликулов. Извлечение ооцитов будет выполнено через 36 часов с помощью вагинальной аспирации иглой под ультразвуковым контролем и с использованием местной анестезии и легкой седации. Во время извлечения у субъектов будет собрано 2 мл слюны, кроме того, будет собрано 2 мл фолликулярной жидкости из первого фолликула, аспирированного из каждого яичника, для определения активности coQ10 с помощью анализа arNOX. ПОСКОЛЬКУ невозможно измерить уровни CoQ10 в отдельных клетках (например, ооциты), ФФ представляет собой непосредственную клеточную среду, которая может отражать метаболический профиль этой клетки. После извлечения ооциты будут оплодотворены с помощью ИКСИ, чтобы не загрязнить материнскую ДНК во время биопсии полярного тела ДНК спермы. На следующий день все ооциты с 2 пронуклеусами будут подвергнуты биопсии одного или обоих полярных телец.

Биопсия полярного тельца Затем ооцит осеменяют с помощью метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) и сохраняют в культуре в инкубаторе. Для биопсии полярного тельца ооцит удерживается удерживающей пипеткой с полярным тельцем в положении 11-12 часов. В прозрачной оболочке делают отверстие, в перивителлиновое пространство вводят полированную стеклянную иглу и осторожно извлекают полярное тельце.

Перенос эмбрионов проводят утром третьего дня после забора яйцеклеток.

Полярные тельца промывают в каплях изотонического HEPES-буферного раствора, а затем переносят в гипотонический раствор, фиксируют в метаноле: уксусной кислоте на предметном стекле и обезвоживают в метаноле для дальнейшего генетического анализа. Вся процедура не оказывает отрицательного влияния ни на скорость оплодотворения, ни на скорость дробления в биопсийных ооцитах, так как полярное тельце не участвует в вышеуказанных процессах. Кариотипирование:

Полярные тельца будут переданы в центр микрочипов UHN для определения числа хромосом. Анализ будет проводиться с помощью коммерческого набора от Advalytix (Olympus Life Science Research, Мюнхен, Германия). Это набор на основе мультиплексной ПЦР, который обеспечивает быстрый и точный подсчет всех 23 хромосом и адаптирован к подсчету хромосом полярного тела. Через 2 дня один эмбрион с нормальным кариотипом будет перенесен в полость матки под ультразвуковым контролем с использованием катетера для переноса Кука (Кук, Сидней, Австралия). Остальные жизнеспособные эмбрионы с нормальным кариотипом будут заморожены (медленная заморозка). Лютеиновая поддержка будет состоять из суппозиториев прогестерона по 100 мг (Kingsway Pharmacy, Торонто, Онтарио, Канада) вагинально 3 раза в день, начиная со дня перевода, и будет продолжаться в течение 2 недель до конца каждого цикла, когда будет взят анализ бета-ХГЧ в сыворотке, и если беременна. , CoQ10/плацебо будет прекращено. При беременности лютеиновая поддержка будет продолжаться до 10 недель беременности. Если пациентка не беременна, ей будет проведен цикл стимуляции эндометрия микронизированным эстрадиолом, а затем прогестероном, как только будет измерена достаточная толщина эндометрия. Через четыре дня после этого 1-2 эмбриона размораживают и переносят. Лютеиновая поддержка будет включать эстрадиол и прогестерон, которые будут поддерживаться до 10 недель при беременности. Эти циклы переноса замороженных эмбрионов будут продолжаться до тех пор, пока есть замороженные эмбрионы из того же извлечения.

Конечными точками исследования будут:

1. Первичным показателем результата будет количество и процент эуплоидных яйцеклеток при извлечении.

2. Вторичные показатели результатов будут включать:

   • ответ яичников
   • Качество эмбриона
   • Кумулятивный коэффициент наступления беременности/извлечение
   • Совокупный коэффициент живорождения / извлечение
   • Активность CoQ10 в слюне и фолликулярной жидкости с помощью анализа arNOX

Анализ коэнзима Q10 arNOX представляет собой ингибируемую коферментом Q10, связанную со старением внешнюю НАДН-оксидазу (ECTO-NOX) клеточной поверхности, которая также присутствует в сыворотке и слюне. Он способен генерировать супероксид, измеряемый как ингибируемое супероксиддисмутазой восстановление феррицитохрома с (окисленный цитохром С). Активность arNOX слюны пожилых людей ингибируется коэнзимом Q10. Активность впервые появляется после 30 лет и достигает почти максимума примерно в 55 лет.

Активность arNOX оценивают по измерениям продукции супероксида на основе стандартного метода, при котором восстановление феррицитохрома с супероксидом отслеживают по увеличению поглощения при 550 нм по сравнению с эталоном при 540 нм. В качестве дополнительной проверки специфичности активности arNOX в конце анализа добавляют супероксиддисмутазу (СОД), чтобы убедиться, что скорость вернулась к исходному уровню. Анализ состоит из 150 мкл (2 мг/мл) раствора окисленного феррицитохрома с и 200 мкл слюны, добавленных к 2,5 мл буфера для анализа (8,06 г NaCl, 0,2 г KC1, 0,18 г Na2HPO4, 0,26 г KH2PO4, 0,13 г CaCl2, 0,1 г MgCl2, 1,35 г глюкозы растворяют в 1000 мл деионизированной воды, рН доводят до 7,4, фильтруют и хранят при 4°С). Скорости определяют с помощью спектрофотометра в двухволновом режиме с непрерывными измерениями (в течение 1 мин каждые 1,5 мин). Через 45 минут добавляют 60 мкл (содержащие 60 единиц) СОД и анализ продолжают еще в течение 45 минут.

Было обнаружено, что arNOX в слюне является удобным и неинвазивным методом мониторинга уровней arNOX в клинических испытаниях вмешательства с коэнзимом Q10, при этом уровни ответа аналогичны уровням, наблюдаемым при arNOX в сыворотке и клетках (Morre and Morre 2008).

Исследуемая популяция

Всего в этом исследовании в Центре передовых репродуктивных технологий TCART-Торонто примут участие 54 пациентки, желающие забеременеть. Каждый субъект должен соответствовать критериям включения и исключения из исследования.

Расчет мощности:

Всего в этом исследовании с параллельным дизайном примут участие 54 пациента. Вероятность того, что исследование обнаружит разницу в лечении при двустороннем исследовании со значением p ≤ 0,01, составляет 90 %, если истинное различие между видами лечения в частоте анеуплоидии составляет 25 %. Это основано на предположении, что стандартное отклонение переменной ответа составляет 0,180.

Назначение на лечение и рандомизация:

Пациенты будут распределены в хронологическом порядке в день включения в исследование для компьютерной рандомизации. Каждый зарегистрированный участник получит предварительно назначенный пакет, содержащий либо плацебо, либо CoQ10 на время исследования. Врач будет ослеплен в отношении распределения пациентов. Рандомизация будет проводиться до начала первого цикла.

Исследователи будут вести отдельные записи, связывающие имена испытуемых с их кодовыми номерами, чтобы при необходимости можно было легко проверить данные в файлах испытуемых.

Статистический анализ будет проводиться с помощью t-критерия Стьюдента для сравнения между группой лечения и группой плацебо для всех показателей результатов. Анализ мощности рассчитывали для альфа <0,01.

Ожидаемые результаты и возможные подводные камни. Количество пациентов, необходимых для исследования, является разумным, и мы не ожидаем, что это станет препятствием. Если результаты этого исследования будут соответствовать результатам исследования на животных, мы сможем показать значительную разницу в количестве эуплоидных эмбрионов между тестовой и контрольной группами, а также в других параметрах результатов. В течение нескольких месяцев мы работали с лабораторией микрочипов UHN над оптимизацией использования набора для мультиплексной ПЦР Advalytics, который в настоящее время работает очень хорошо. Никаких проблем с этой составляющей объекта мы не ожидаем.