체외 수정의 임신 결과에 대한 불임 약물과 공동 효소 Q10의 효과 (CoQ10-IVF)

이 연구의 목적은 CoQ10 투여가 난모세포의 이배수성 비율 및 누적 출생률에 미치는 영향과 관련하여 효능을 평가하는 것입니다.

연구 설계 이것은 전향적 무작위 위약 대조 연구입니다. 연구 참가자는 이 프로토콜의 일부로 최대 3주기를 거칩니다. 모든 임상 평가는 참여 불임 클리닉에서 수행됩니다.

연구는 고급 생식 기술을 위한 토론토 센터(TCART)에서 외래환자 기준으로 조직될 것입니다. 이 연구에는 IVF 치료를 받고 있는 35-43세의 여성 54명이 참여합니다. 모든 여성은 arNOX 분석(아래 설명)으로 coQ10 활성의 기준선 측정을 위해 5mL 폴리에틸렌 튜브에 2mL의 타액을 수집합니다.

연구 참가자는 위약 또는 COQ10 캡슐에 무작위로 배정됩니다(AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD 등록 코드 135307). 연구 참가자는 IVF 주기 전 2개월 동안 아침 식사 또는 동일한 위약 캡슐과 함께 하루에 한 번 600mg의 CoQ10을 경구로 복용하고 임신하지 않은 경우 최대 3주기를 복용합니다. 주기 3일째에 피험자는 보충제를 계속 섭취하면서 시험관 수정을 위한 난소 자극을 시작합니다. 통제된 난소 자극(COH)은 나이든 여성을 위한 클리닉의 표준 프로토콜인 마이크로도즈 GnRH 작용제 플레어 프로토콜로 구성됩니다. COH는 재조합 FSH(Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Canada) 또는 인간 갱년기 성선 자극 호르몬(Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Canada) 150 단위를 1일 2회 S.C. 및 Buserelin Acetate(Superfact, Sanofi)를 사용하여 수행됩니다. - Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0.05 mg 피하 B.I.D, 10,000 단위 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)(Pregnyl, Organon) 전날까지 계속됩니다. 투여량은 변경되지 않으며 연구 기간 동안 유지되어야 합니다. 두 약물 모두 난포 발달이 적절하다고 판단될 때까지(적어도 3개의 난포>17mm, 존재하는 난포의 수에 따라 E2 수준이 허용될 때까지) 매일 계속되며, 이때 hCG가 최종 난포 성숙을 유발하기 위해 주입됩니다. 난자 회수는 36시간 후 질 초음파 유도 바늘 흡인과 국소 마취 및 약한 진정제를 사용하여 수행됩니다. 채취 시 피험자는 arNOX 분석으로 coQ10 활성을 측정하기 위해 각 난소에서 흡인된 첫 번째 난포에서 2mL의 타액을 채취하고 추가로 2mL의 난포액을 채취합니다. AS 단일 세포에서 CoQ10 수치를 측정하는 것은 불가능합니다(예: 난모세포), FF는 이 세포의 대사 프로필을 반영할 수 있는 직접적인 세포 환경을 나타냅니다. 적출된 난자는 정자 DNA로 극체 생검 샘플을 채취하는 동안 산모의 DNA가 오염되지 않도록 ICSI로 수정됩니다. 다음날 2개의 전핵을 가진 모든 난모세포는 한쪽 또는 양쪽 극체의 생검을 받게 됩니다.

극체 생검 난모세포는 세포질 내 정자 주입(ICSI) 기술을 사용하여 수정되고 인큐베이터에서 배양됩니다. 극체를 생검하기 위해서는 극체가 11-12시 위치에 있도록 홀딩 피펫으로 난자를 고정한다. Zona pellucida에 구멍을 만들고 연마된 유리 바늘을 vivitelline 공간에 삽입하고 극체를 조심스럽게 제거합니다.

배아 이식은 난자 채취 후 3일째 되는 날 아침에 시행합니다.

극체는 등장성 HEPES-완충 식염수 방울에서 세척된 다음 저장성 용액으로 옮겨지고, 메탄올에 고정됩니다: 유리 슬라이드 위의 아세트산, 추가 유전 분석을 위해 메탄올에서 탈수됩니다. 극체는 위의 과정에 관여하지 않기 때문에 전체 절차는 생검된 난모세포의 수정 또는 분열 속도에 악영향을 미치지 않습니다.핵형 분석:

극체는 염색체 번호 결정을 위해 UHN 마이크로어레이 센터로 옮겨집니다. 분석은 Advalytix(Olympus Life Science Research, Munich, Germany)의 상용 키트로 수행됩니다. 23개 염색체 전체를 신속하고 정확하게 카운트하고 극체 염색체 카운트에 맞춘 다중 PCR 기반 키트입니다. 2일 후 정상 핵형을 가진 단일 배아가 Cook 이동 카테터(Cook, Sidney, Australia)를 사용하여 초음파 안내 하에 자궁강으로 이동됩니다. 정상적인 핵형을 가진 나머지 생존 가능한 배아는 동결됩니다(저속 동결). 황체 지원은 프로게스테론 좌약 100mg(Kingsway Pharmacy,Toronto, Ontario Canada)으로 구성되며 이송 당일부터 1일 3회 질내 투여되며 혈청 베타 hCG가 채취되고 임신한 경우 각 주기가 끝날 때까지 2주 동안 지속됩니다. , CoQ10/플라시보가 중단됩니다. 임신한 경우 황체기 지원은 임신 10주까지 계속됩니다. 환자가 임신하지 않은 경우 미분화된 에스트라디올로 자궁내막 자극 주기를 갖게 되며 충분한 자궁내막 두께가 측정되면 프로게스테론이 뒤따릅니다. 4일 후 1-2개의 배아를 해동하여 이식합니다. 황체 지원에는 임신한 경우 최대 10주까지 유지되는 에스트라디올과 프로게스테론이 포함됩니다. 이러한 냉동 배아 이식 주기는 동일한 검색에서 냉동 배아가 있는 한 계속됩니다.

연구 종점은 다음과 같습니다.

1. 1차 결과 측정은 회수당 정배수체 난의 수와 백분율이 될 것입니다.

2. 이차 결과 측정에는 다음이 포함됩니다.

   • 난소 반응
   • 배아 품질
   • 누적임신율/회수
   • 누적생아율/회수
   • arNOX 분석에 의한 타액 및 여포액에서의 CoQ10 활성

코엔자임 Q10 분석 arNOX는 혈청과 타액에도 존재하는 세포 표면의 코엔자임 Q10 억제, 노화 관련 외부 NADH 산화효소(ECTO-NOX) 단백질입니다. 페리시토크롬 c(Oxidaised cytochrome C)의 수퍼옥사이드 디스뮤타제 억제 환원으로 측정된 수퍼옥사이드 생성이 가능합니다. 노인 타액의 arNOX 활성은 코엔자임 Q10에 의해 억제됩니다. 이 활동은 30세 이후에 처음 나타나며 약 55세에 거의 최대에 가깝습니다.

arNOX 활성은 초과산화물에 의한 페리시토크롬 c의 감소가 540nm에서 기준으로 550nm에서의 흡광도 증가로부터 모니터링되는 표준 방법에 기초한 초과산화물 생성의 측정으로부터 검정된다. arNOX 활성의 특이성에 대한 추가 검사로서, SOD(슈퍼옥사이드 디스뮤타제)를 분석 종료 시에 추가하여 속도가 기준선으로 돌아왔는지 확인합니다. 분석은 150μl(2mg/ml) 산화된 페리시토크롬 c 용액과 200μl의 타액을 2.5ml 분석 완충액(8.06g NaCl, 0.2g KCl, 0.18g Na 2HPO4, 0.26g KH2PO4, 0.13g CaCl2, 0.1g g MgCl2, 1000ml 탈이온수에 용해된 1.35g 포도당, pH 7.4로 조정, 여과 및 4ºC에서 보관). 속도는 연속 측정(1.5분마다 1분 이상)으로 이중 파장 모드에서 분광 광도계를 사용하여 결정됩니다. 45분 후, SOD 60㎕(60유닛 함유)를 첨가하고 분석을 추가 45분 동안 계속한다.

타액 arNOX는 임상 코엔자임 Q10 개입 시험에서 arNOX 수준을 모니터링하기 위한 편리하고 비침습적인 방법으로 밝혀졌으며 반응 수준은 혈청 및 세포 arNOX에서 관찰되는 것과 유사합니다(Morre and Morre 2008).

연구 인구

임신을 원하는 총 54명의 여성 환자가 TCART-토론토 고급 생식 기술 센터에서 이 연구에 등록됩니다. 각 피험자는 연구 포함 및 제외 기준을 충족해야 합니다.

전력 계산:

총 54명의 환자가 이 2가지 치료 병렬 설계 연구에 참여할 것입니다. 이수성 비율의 치료 간 실제 차이가 25%인 경우 연구가 p-값 ≤ 0.01인 양면에서 치료 차이를 감지할 확률은 90%입니다. 이는 반응변수의 표준편차가 0.180이라는 가정에 근거한 것이다.

치료에 할당 및 무작위화:

환자는 연구 등록일에 연대순으로 컴퓨터 생성 무작위화에 배정됩니다. 등록된 각 참가자는 연구 기간 동안 위약 또는 CoQ10이 포함된 미리 지정된 패키지를 받게 됩니다. 의사는 환자 배정에 대해 눈이 멀 것입니다. 무작위화는 첫 번째 주기를 시작하기 전에 수행됩니다.

조사관은 필요할 때 주제 파일의 데이터를 쉽게 확인할 수 있도록 주제 이름과 코드 번호를 연결하는 별도의 기록을 보관합니다.

통계적 분석은 모든 결과 측정에 대해 치료군과 위약군 사이에 캠퍼에 대한 학생 t-테스트로 수행됩니다. 전력 분석은 알파 < 0.01에 대해 계산되었습니다.

예상 결과 및 잠재적 위험. 연구에 필요한 환자의 수는 합리적이며 장애가 될 것으로 예상하지 않습니다. 이 연구의 결과가 동물 연구에 대한 것이라면 우리는 테스트 그룹과 대조군 사이의 정배수체 배아 수와 다른 결과 매개변수의 유의미한 차이를 보여줄 수 있어야 합니다. 우리는 현재 매우 잘 작동하는 Advalytics 다중 PCR 키트의 사용을 최적화하기 위해 UHN 마이크로어레이 연구실과 몇 달 동안 협력해 왔습니다. 개체의 이 구성 요소에 문제가 없을 것으로 예상됩니다.