Vliv koenzymu Q10 spolu s léky na plodnost na výsledek těhotenství in vitro fertilizace (CoQ10-IVF)

Cílem této studie je zhodnotit účinnost podávání CoQ10 s ohledem na jeho vliv na míru aneuploidie oocytů a kumulativní míru porodnosti.

Design studie Toto je prospektivní randomizovaná placebem kontrolovaná studie. Účastníci studie podstoupí v rámci tohoto protokolu až 3 cykly. Všechna klinická hodnocení budou prováděna na zúčastněných klinikách neplodnosti.

Studie bude organizována ambulantně v Torontském centru pro pokročilé reprodukční technologie (TCART). Studie se zúčastní 54 žen ve věku 35–43 let podstupujících léčbu IVF. Všechny ženy odeberou 2 ml slin do 5 ml polyethylenové zkumavky pro základní měření aktivity coQ10 pomocí testu arNOX (popsáno níže).

Účastníci studie budou náhodně rozděleni do skupin s placebem nebo COQ10 kapslemi (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, registrační kódy NHPD 135307). Účastníci studie budou užívat 600 mg CoQ10 perorálně jednou denně se snídaní nebo identické placebo tobolky po dobu 2 měsíců před cyklem IVF a až 3 cykly, pokud nenastane těhotenství. V den cyklu 3 subjekty zahájí stimulaci vaječníků pro oplodnění in vitro, přičemž budou pokračovat v konzumaci doplňků. Řízená ovariální stimulace (COH) se bude skládat z protokolu vzplanutí mikrodávkového agonisty GnRH, což je standardní protokol kliniky pro starší ženy. COH se bude provádět pomocí rekombinantního FSH (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Kanada) nebo lidských menopauzálních gonadotropinů (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Kanada) 150 jednotek dvakrát denně SC a Buserelin acetát (Superfact, Sanofi -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg subkutánně B.I.D a bude pokračovat až do dne předcházejícího podání 10 000 jednotek lidského choriového gonadotropinu (hCG) (Pregnyl, Organon). Dávkování se nezmění a musí být zachováno po dobu trvání studie. Obě léčiva budou pokračovat denně, dokud nebude vývoj folikulů považován za adekvátní (alespoň 3 folikuly >17 mm a hladina E2 je přijatelná pro počet přítomných folikulů), kdy bude injikován hCG ke spuštění konečného zrání folikulů. Odběr oocytů bude proveden o 36 hodin později vaginální ultrazvukovou aspirací jehlou a za použití lokální anestezie a mírné sedace. V době odběru se subjektům odeberou 2 ml slin, navíc se odeberou 2 ml folikulární tekutiny z prvního folikulu odsátého z každého vaječníku pro stanovení aktivity coQ10 testem arNOX. Jelikož není možné měřit hladiny CoQ10 v jednotlivých buňkách (např. oocyty), FF představuje přímé buněčné prostředí, které může odrážet metabolický profil této buňky. Po odběru budou oocyty oplodněny pomocí ICSI, aby nedošlo ke kontaminaci mateřské DNA během vzorku biopsie polárního těla DNA spermií. Následující den budou všechny oocyty se 2 pronukley podrobeny biopsii jednoho nebo obou polárních tělísek.

Biopsie polárního tělíska Oocyt je poté inseminován pomocí techniky intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI) a je udržován v kultuře v inkubátoru. Za účelem biopsie polárního tělíska je oocyt držen přidržovací pipetou s polárním tělíčkem v poloze 11-12 hodin. V zona pellucida se vytvoří otvor a do perivitelinárního prostoru se zavede leštěná skleněná jehla a polární tělísko se opatrně vyjme.

Transfer embrya se provádí ráno třetího dne po odběru vajíček.

Polární tělíska jsou promyta v kapkách izotonického fyziologického roztoku pufrovaného HEPES a poté přenesena do hypotonického roztoku, fixována ve směsi methanol:kyselina octová na podložním sklíčku a dehydratována v methanolu pro další genetickou analýzu. Celý postup neovlivňuje nepříznivě ani oplodnění, ani rychlost štěpení v bioptických oocytech, protože polární tělísko není zapojeno do výše uvedených procesů. Karyotypizace:

Polární tělíska budou přenesena do UHN microarray centra pro určení počtu chromozomů. Analýza bude provedena pomocí komerční soupravy od Advalytix (Olympus Life Science Research, Mnichov, Německo). Jedná se o soupravu založenou na multiplexní PCR, která poskytuje rychlý a přesný počet všech 23 chromozomů a je přizpůsobena počtu chromozomů polárního těla. Po 2 dnech bude jedno embryo s normálním karyotypem přeneseno do děložní dutiny pod ultrazvukovým vedením pomocí přenosového katétru Cook (Cook, Sidney, Austrálie). Zbytek životaschopných embryí s normálním karyotypem bude zmrazen (pomalé zmrazení). Luteální podpora se bude skládat z progesteronových čípků 100 mg (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario Kanada) vaginálně 3krát denně počínaje dnem přenosu a bude pokračovat po dobu 2 týdnů až do konce každého cyklu, kdy bude odebráno sérum beta hCG a pokud jste těhotná , CoQ10/placebo bude přerušeno. Pokud je těhotná, luteální podpora bude pokračovat až do 10. týdne těhotenství. Pokud pacientka není těhotná, podstoupí cyklus stimulace endometria mikronizovaným estradiolem, po kterém bude následovat progesteron, jakmile bude změřena dostatečná tloušťka endometria. Čtyři dny poté budou 1-2 embrya rozmražena a přenesena. Luteální podpora bude zahrnovat estradiol a progesteron, které budou udržovány až 10 týdnů, pokud jste těhotná. Tyto cykly přenosu zmrazených embryí budou pokračovat, dokud budou existovat zmrazená embrya ze stejného odběru.

Koncové body studie budou:

1. Primárním měřítkem výsledku bude počet a procento euploidních vajíček na jeden odběr

2. Sekundární výsledná opatření budou zahrnovat:

   • Odezva vaječníků
   • Kvalita embrya
   • Kumulativní míra těhotenství / vyhledávání
   • Kumulativní živá porodnost / vyhledávání
   • Aktivita CoQ10 ve slinách a folikulární tekutině testem arNOX

Test koenzymu Q10 arNOX je koenzymem Q10 inhibovaný, se stárnutím související externí protein NADH oxidázy (ECTO-NOX) na buněčném povrchu, který je také přítomen v séru a slinách. Je schopen tvorby superoxidu měřené jako superoxiddismutázou inhibovaná redukce ferricytochromu c (oxidovaný cytochrom C). Aktivitu arNOX slin starších jedinců inhibuje koenzym Q10. Aktivita se poprvé objevuje po 30 letech až do téměř maxima přibližně ve věku 55 let.

Aktivita arNOX je stanovena z měření produkce superoxidu na základě standardní metody, kde je redukce ferricytochromu c superoxidem sledována z nárůstu absorbance při 550 nm s referencí při 540 nm. Jako další kontrola specifičnosti aktivity arNOX se ke konci testu přidá superoxiddismutáza (SOD), aby se zjistilo, že se rychlost vrátila na základní linii. Test sestává ze 150 μl (2 mg/ml) oxidovaného roztoku ferricytochromu c a 200 μl slin přidaných do 2,5 ml zkušebního pufru (8,06 g NaCl, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g KH2PO4, 0,13 g g MgCl2, 1,35 g glukózy rozpuštěné v 1000 ml deionizované vody, upraveno na pH 7,4, zfiltrováno a skladováno při 4 °C). Rychlosti jsou stanoveny pomocí spektrofotometru v režimu duální vlnové délky s kontinuálním měřením (přes 1 min každých 1,5 min). Po 45 minutách se přidá 60 ul (obsahující 60 jednotek) SOD a v testu se pokračuje dalších 45 minut.

Bylo zjištěno, že slinný arNOX je pohodlnou a neinvazivní metodou k monitorování hladin arNOX v klinických intervenčních studiích koenzymu Q10 s hladinami odezvy paralelními s hladinami pozorovanými u sérového a buněčného arNOX (Morre a Morre 2008).

Studijní populace

Do této studie v TCART-Toronto Center for Advanced Reproductive Technology bude zařazeno celkem 54 pacientek, které si přejí otěhotnět. Každý subjekt musí splňovat kritéria pro zařazení a vyloučení ze studie

Výpočet výkonu:

Celkem 54 pacientů vstoupí do této studie paralelního designu se dvěma léčebnými postupy. Pravděpodobnost je 90 procent, že studie detekuje rozdíl v léčbě na obou stranách s hodnotou p ≤ 0,01, pokud je skutečný rozdíl mezi léčbami v míře aneuploidie 25 %. To je založeno na předpokladu, že směrodatná odchylka proměnné odezvy je 0,180.

Přiřazení k léčbě a randomizace:

Pacienti budou zařazeni v chronologickém pořadí v den zařazení do studie do počítačem generované randomizace. Každý přihlášený účastník obdrží předem přidělený balíček obsahující buď placebo nebo CoQ10 po dobu trvání studie. Lékař bude zaslepen, pokud jde o přidělení pacientů. Randomizace bude provedena před zahájením prvního cyklu.

Vyšetřovatelé budou uchovávat samostatný záznam týkající se jmen subjektů a jejich kódových čísel, aby v případě potřeby umožnili snadnou kontrolu údajů v souborech subjektů.

Statistická analýza bude provedena studentským t-testem na táborník mezi léčenou a placebovou skupinou pro všechna výsledná měření. Výkonová analýza byla vypočtena pro alfa < 0,01.

Očekávané výsledky a potenciální úskalí. Počet pacientů potřebných pro studii je přiměřený a nepředpokládáme, že by to bylo překážkou. Pokud budou výsledky této studie pocházet ze studie na zvířatech, měli bychom být schopni prokázat významný rozdíl v počtu euploidních embryí mezi testovací a kontrolní skupinou, stejně jako s ostatními výstupními parametry. Několik měsíců jsme pracovali s laboratoří mikročipů UHN na optimalizaci použití soupravy Advalytics multiplex PCR, která v současnosti funguje velmi dobře. S touto komponentou objektu neočekáváme žádné problémy.