A Q10 koenzim hatása a termékenységi gyógyszerekkel együtt az in vitro megtermékenyítés terhességi kimenetelére (CoQ10-IVF)

Ennek a tanulmánynak a célja a CoQ10 adagolásának hatékonyságának értékelése a petesejtek aneuploidiájára és a kumulatív élveszületési rátára gyakorolt ​​hatás tekintetében.

A vizsgálat felépítése Ez egy prospektív, randomizált, placebo-kontrollos vizsgálat. Ennek a protokollnak a részeként a vizsgálat résztvevői legfeljebb 3 cikluson esnek át. Minden klinikai értékelést a részt vevő meddőségi klinikákon végeznek el.

A tanulmányt járóbeteg-alapon szervezik meg a Torontói Fejlett Reprodukciós Technológiai Központban (TCART). A vizsgálatban 54, 35-43 év közötti nő vesz részt, akik IVF-kezelésen vesznek részt. Minden nő 2 ml nyálat gyűjt egy 5 ml-es polietilén csőben a coQ10 aktivitás kiindulási méréséhez arNOX vizsgálattal (lásd alább).

A vizsgálatban résztvevőket véletlenszerűen placebóhoz vagy COQ10 kapszulákhoz osztják be (AOR – Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD regisztrációs kódok 135307). A vizsgálatban résztvevők 600 mg CoQ10-et kapnak szájon át naponta egyszer reggelivel vagy azonos placebo kapszulákkal az IVF ciklus előtt 2 hónapig, és legfeljebb 3 ciklusig, ha nem következik be terhesség. A ciklus 3. napján az alanyok megkezdik a petefészek stimulálását in vitro megtermékenyítés céljából, miközben folytatják a kiegészítők fogyasztását. A kontrollált petefészek-stimuláció (COH) a mikrodózisú GnRH agonista fellángolási protokollból áll, amely a klinika standard protokollja az idősebb nők számára. A COH rekombináns FSH-val (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Kanada) vagy humán menopauzális gonadotropinokkal (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Kanada) történik, naponta kétszer 150 egység S.C. és Buserelin-acetát (Superfact, Sanofi) -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg szubkután B.I.D, és a 10 000 egység humán koriongonadotropin (hCG) (Pregnyl, Organon) előtti napig folytatódik. Az adagolás nem változik, és a vizsgálat időtartama alatt fenn kell tartani. Mindkét gyógyszert naponta folytatják, amíg megfelelőnek nem ítélik a tüszőfejlődést (legalább 3 tüsző >17 mm, és az E2-szint elfogadható a jelenlévő tüszők számára), ekkor a hCG-t beinjektálják a végső tüszőérés kiváltására. A petesejtek kinyerésére 36 órával később kerül sor hüvelyi ultrahang által irányított tű szívással, helyi érzéstelenítés és enyhe szedáció alkalmazásával. A visszanyeréskor az alanyok 2 ml nyálat gyűjtenek, ezenkívül 2 ml tüszőfolyadékot gyűjtenek az egyes petefészekből leszívott első tüszőből a coQ10 aktivitás arNOX vizsgálattal történő meghatározásához. Mivel nem lehet CoQ10 szintet mérni egyetlen sejtben (pl. oociták), az FF közvetlen sejtes környezetet képvisel, amely tükrözheti ennek a sejtnek a metabolikus profilját. A visszanyerés után a petesejteket ICSI-vel megtermékenyítik, hogy a poláris test biopsziás mintája során ne szennyezzék az anyai DNS-t spermium DNS-sel. A következő napon az összes 2 pronukleuszú oocitán az egyik vagy mindkét poláris test biopsziáját vetik alá.

Poláris test biopszia A petesejteket intracitoplazmatikus spermium injekció (ICSI) technikával megtermékenyítik, és inkubátorban tenyészetben tartják. A poláris test biopsziájához a petesejteket a tartópipetta tartja úgy, hogy a poláris test 11-12 óra között van. A zona pellucida-ban nyílást készítenek, és egy csiszolt üvegtűt vezetnek be a perivitell térbe, és óvatosan eltávolítják a poláris testet.

Az embrióátültetést a petefelvételt követő harmadik nap reggelén hajtják végre.

A sarki testeket izotóniás HEPES-pufferolt sóoldatcseppekben mossuk, majd hipotóniás oldatba visszük át, metanol:ecetsavban rögzítjük egy tárgylemezen, majd metanolban dehidratáljuk a további genetikai elemzéshez. Az egész eljárás nem befolyásolja hátrányosan sem a megtermékenyítést, sem a hasadási arányt a biopsziás petesejtekben, mivel a poláris test nem vesz részt a fenti folyamatokban. Kariotipizálás:

A poláris testek átkerülnek az UHN microarray központjába kromoszómaszám meghatározásához. Az elemzés az Advalytix (Olympus Life Science Research, München, Németország) kereskedelmi készletével történik. Ez egy multiplex PCR-alapú készlet, amely mind a 23 kromoszóma gyors és pontos megszámlálását biztosítja, és a poláris test kromoszómaszámára van szabva. 2 nap elteltével egyetlen normál kariotípusú embriót ultrahangos irányítás mellett Cook transzfer katéterrel (Cook, Sidney, Ausztrália) visszük át a méh üregébe. A többi, normális kariotípusú életképes embriót lefagyasztják (lassú fagyasztás). A luteális támogatás 100 mg progeszteron kúpokból áll (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario Kanada) naponta háromszor, az áthelyezés napjától kezdődően, és 2 hétig tart minden ciklus végéig, amikor a szérum béta-hCG-t le kell venni, és ha terhes. , a CoQ10/placebo abbahagyásra kerül. Terhesség esetén a luteális támogatás a terhesség 10 hetéig folytatódik. Ha a beteg nem terhes, mikronizált ösztradiollal végeznek méhnyálkahártya-stimulációt, majd progeszteront, miután elegendő méhnyálkahártya vastagságot mértek. Négy nappal ezután 1-2 embriót felolvasztanak és áthelyeznek. A luteális támogatás magában foglalja az ösztradiolt és a progeszteront, amelyeket terhesség esetén 10 hétig fenntartanak. A fagyasztott embriótranszfer ezen ciklusai mindaddig folytatódnak, amíg vannak lefagyasztott embriók ugyanabból a levételből.

A vizsgálat végpontjai a következők lesznek:

1. Az elsődleges eredmény mértéke az euploid tojások száma és százalékos aránya lesz visszanyerésenként

2. A másodlagos kimeneti intézkedések a következőket tartalmazzák:

   • A petefészek válasza
   • Az embrió minősége
   • kumulatív terhességi arány / visszakeresés
   • kumulatív élveszületési arány / visszakeresés
   • CoQ10 aktivitás a nyálban és a follikuláris folyadékban arNOX vizsgálattal

Koenzim Q10 vizsgálat Az arNOX egy koenzim Q10 által gátolt, öregedéssel összefüggő külső NADH-oxidáz (ECTO-NOX) fehérje a sejtfelszínen, amely a szérumban és a nyálban is jelen van. Képes szuperoxid-képződésre, a ferricitokróm c (oxidált citokróm C) szuperoxid-diszmutáz-gátolt redukciójaként mérve. Az idősebb egyének nyálának arNOX aktivitását a Q10 koenzim gátolja. Az aktivitás először 30 éves kor után jelentkezik, és körülbelül 55 éves korban jelentkezik a maximumon.

Az arNOX-aktivitást a szuperoxid-termelés mérései alapján határozzák meg a standard módszer alapján, ahol a ferricitokróm c szuperoxiddal történő redukcióját az 550 nm-en mért abszorbancia-növekedés alapján, 540 nm-en referenciaként mérik. Az arNOX aktivitás specifitásának további ellenőrzéseként a vizsgálat vége felé szuperoxid-diszmutázt (SOD) adunk hozzá, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy az arány visszatért-e az alapvonalhoz. A teszt 150 μl (2 mg/ml) oxidált ferricitokróm c oldatból és 200 μl nyálból áll, amelyet 2,5 ml vizsgálati pufferhez (8,06 g NaC1, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g.1CH21,26 g. g MgCl2, 1,35 g glükóz 1000 ml ionmentesített vízben oldva, pH-ját 7,4-re állítjuk, szűrjük és 4 °C-on tároljuk). A sebességeket spektrofotométerrel határozzuk meg kettős hullámhosszú üzemmódban, folyamatos mérésekkel (1 percenként 1,5 percenként). 45 perc elteltével 60 μl (60 egységet tartalmazó) SOD-t adunk hozzá, és a vizsgálatot további 45 percig folytatjuk.

A nyálból származó arNOX kényelmes és nem invazív módszernek bizonyult az arNOX-szintek monitorozására a Q10 koenzim klinikai beavatkozási kísérletekben, ahol a válaszszintek párhuzamosak a szérum és a sejt arNOX-éval (Morre és Morre 2008).

Vizsgálati populáció

A TCART-Torontói Fejlett Reprodukciós Technológiai Központban összesen 54 terhességre vágyó nőbeteget vonnak be ebbe a vizsgálatba. Minden tantárgynak meg kell felelnie a tanulmányi felvételi és kizárási kritériumoknak

Teljesítmény számítás:

Összesen 54 beteg vesz részt ebben a két kezeléssel párhuzamosan tervezett vizsgálatban. 90 százalék a valószínűsége annak, hogy a vizsgálat kétoldali kezelési különbséget fog kimutatni, ha p-értéke ≤ 0,01, ha a kezelések közötti valódi különbség az aneuploiditás arányában 25%. Ez azon a feltételezésen alapul, hogy a válaszváltozó szórása 0,180.

A kezeléshez és a randomizáláshoz való hozzárendelés:

A betegeket a vizsgálat napján időrendi sorrendben hozzárendelik egy számítógép által generált randomizáláshoz. Minden beiratkozott résztvevő kap egy előre kijelölt csomagot, amely vagy placebót vagy CoQ10-et tartalmaz a vizsgálat idejére. Az orvos vak lesz a betegek beosztását illetően. A véletlenszerűsítésre az első ciklus megkezdése előtt kerül sor.

A nyomozók külön nyilvántartást vezetnek az alanyok nevének kódszámaihoz kapcsolódóan, hogy szükség esetén könnyen ellenőrizhessék az alanyok aktáiban található adatokat.

A statisztikai elemzést tanulói t-próbával végzik a táborozóval a kezelt és a placebócsoport között az összes eredménymérő esetében. A teljesítményanalízist alfa < 0,01 értékre számítottuk.

Várható eredmények és lehetséges buktatók. A vizsgálathoz szükséges betegek száma ésszerű, nem számítunk akadálynak. Ha ennek a vizsgálatnak az eredményei az állatkísérletekre vonatkoznak, akkor szignifikáns különbséget kell tudnunk mutatni az euploid embriók számában a teszt- és a kontrollcsoportok között, valamint a többi eredményparaméter között. Több hónapja dolgozunk az UHN microarray laborral, hogy optimalizáljuk a jelenleg nagyon jól működő Advalytics multiplex PCR készlet használatát. Az objektum ezen összetevőjével kapcsolatban nem számítunk problémákra.