O efeito da coenzima Q10 junto com drogas de fertilidade no resultado da fertilização in vitro na gravidez (CoQ10-IVF)

O objetivo deste estudo é avaliar a eficácia da administração de CoQ10 em relação ao seu efeito na taxa de aneuploidia de oócitos e na taxa cumulativa de nascidos vivos.

Desenho do estudo Este é um estudo prospectivo randomizado controlado por placebo. Os participantes do estudo serão submetidos a até 3 ciclos como parte deste protocolo. Todas as avaliações clínicas serão realizadas nas clínicas de infertilidade participantes.

O estudo será organizado em nível ambulatorial no Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology (TCART). O estudo envolverá 54 mulheres com idades entre 35 e 43 anos em tratamento de fertilização in vitro. Todas as mulheres irão coletar 2 mL de saliva em um tubo de polietileno de 5 mL para medição basal da atividade de coQ10 por ensaio de arNOX (descrito abaixo).

Os participantes do estudo serão aleatoriamente designados para placebo ou cápsulas de COQ10, (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, códigos de registro NHPD 135307). Os participantes do estudo tomarão 600 mg de CoQ10 por via oral uma vez ao dia com café da manhã ou cápsulas de placebo idênticas por 2 meses antes de um ciclo de fertilização in vitro e até 3 ciclos se a gravidez não ocorrer. No dia 3 do ciclo, os indivíduos iniciarão a estimulação ovariana para fertilização in vitro enquanto continuam o consumo dos suplementos. A estimulação ovariana controlada (COH) consistirá no protocolo de microdose de agonista de GnRH, que é o protocolo padrão da clínica para mulheres idosas. COH será feito usando FSH recombinante (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Canadá) ou gonadotrofinas menopáusicas humanas (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Canadá) 150 unidades duas vezes ao dia S.C. e Buserelin Acetate (Superfact, Sanofi -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg por via subcutânea B.I.D, e continuará até o dia anterior a 10.000 unidades de gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Pregnyl, Organon). A dosagem não será alterada e deve ser mantida durante o estudo. Ambas as drogas continuarão diariamente até que o desenvolvimento folicular seja considerado adequado (pelo menos 3 folículos >17 mm e o nível de E2 seja aceitável para o número de folículos presentes), momento em que o hCG será injetado para desencadear a maturação folicular final. A recuperação dos oócitos será feita 36 horas depois por aspiração com agulha guiada por ultrassom vaginal e com o uso de anestesia local e sedação leve. No momento da coleta, os indivíduos coletarão 2 mL de saliva, além disso, 2 mL de fluido folicular serão coletados do primeiro folículo aspirado de cada ovário para determinação da atividade de coQ10 pelo ensaio arNOX. COMO não é possível medir os níveis de CoQ10 em uma única célula (por exemplo, oócitos), FF representa ambiente celular direto que pode refletir o perfil metabólico desta célula. Após a coleta, os oócitos serão fertilizados com ICSI para não contaminar o DNA materno durante a biópsia de corpo polar com DNA espermático. No dia seguinte, todos os ovócitos com 2 pronúcleos serão submetidos à biópsia de um ou ambos os corpúsculos polares.

Biópsia de corpo polar O oócito é então inseminado pela técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) e mantido em cultura em incubadora. Para fazer a biópsia do corpo polar, o oócito é retido pela pipeta de retenção com o corpo polar na posição de 11-12 horas. É feita uma abertura na zona pelúcida e uma agulha de vidro polido é introduzida no espaço perivitelino e o corpo polar é cuidadosamente removido.

A transferência do embrião é realizada na manhã do terceiro dia após a retirada dos ovos.

Os corpos polares são lavados em gotas de solução salina tamponada com HEPES isotônico e depois transferidos para solução hipotônica, fixados em metanol: ácido acético em uma lâmina de vidro e desidratados em metanol para posterior análise genética. Todo o procedimento não afeta adversamente as taxas de fertilização ou clivagem em oócitos biopsiados, pois o corpo polar não está envolvido nos processos acima.Cariótipo:

Os corpos polares serão transferidos para o centro de microarranjos UHN para determinação do número de cromossomos. A análise será feita com um kit comercial da Advalytix (Olympus Life Science Research, Munique, Alemanha). Este é um kit baseado em PCR multiplex que fornece uma contagem rápida e precisa de todos os 23 cromossomos e é adaptado à contagem de cromossomos do corpo polar. Após 2 dias, um único embrião com cariótipo normal será transferido para a cavidade uterina sob orientação de ultrassom usando um cateter de transferência Cook (Cook, Sidney, Austrália). Os demais embriões viáveis ​​com cariótipo normal serão congelados (congelamento lento). O suporte lúteo consistirá em supositórios de progesterona 100 mg (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario Canada) por via vaginal 3 vezes ao dia, começando no dia da transferência e continuará por 2 semanas até o final de cada ciclo, quando o beta hCG sérico será coletado e se estiver grávida , CoQ10/placebo será descontinuado. Se estiver grávida, o suporte lúteo continuará até 10 semanas de gestação. Se a paciente não estiver grávida, ela fará um ciclo de estimulação endometrial com estradiol micronizado, seguido de progesterona, uma vez que uma espessura endometrial suficiente tenha sido medida. Quatro dias depois, 1-2 embriões serão descongelados e transferidos. O suporte lúteo incluirá estradiol e progesterona, que serão mantidos até 10 semanas se estiver grávida. Esses ciclos de transferência de embriões congelados continuarão enquanto houver embriões congelados da mesma coleta.

Os endpoints do estudo serão:

1. A medida de resultado primário será o número e a porcentagem de ovos euploides por recuperação

2. As medidas de resultados secundários incluirão:

   • resposta ovariana
   • qualidade do embrião
   • Taxa de gravidez cumulativa/recuperação
   • Taxa cumulativa de nascidos vivos/recuperação
   • Atividade de CoQ10 na saliva e fluido folicular por ensaio arNOX

Ensaio da coenzima Q10 arNOX é uma proteína NADH oxidase externa (ECTO-NOX) inibida pela coenzima Q10, relacionada ao envelhecimento, da superfície celular que também está presente no soro e na saliva. É capaz de geração de superóxido medido como redução inibida pela superóxido dismutase do ferricitocromo c (citocromo C oxidado). A atividade arNOX da saliva de indivíduos mais velhos é inibida pela coenzima Q10. A atividade aparece pela primeira vez após os 30 anos de idade e atinge um máximo próximo aos 55 anos.

A atividade de arNOX é testada a partir de medições da produção de superóxido com base no método padrão onde a redução de ferricitocromo c por superóxido é monitorada a partir do aumento da absorbância a 550 nm com referência a 540 nm. Como uma verificação adicional da especificidade da atividade arNOX, superóxido dismutase (SOD) é adicionado próximo ao final do ensaio para verificar se a taxa voltou à linha de base. O ensaio consiste em 150 μl (2 mg/ml) de solução de ferricitocromo c oxidado e 200 μl de saliva adicionados a 2,5 ml de tampão de ensaio (8,06 g NaC1, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g KH2PO4, 0,13 g CaCl2, 0,1 g MgCl2, 1,35 g de glicose dissolvida em 1000 ml de água deionizada, ajustada para pH 7,4, filtrada e armazenada a 4◦C). As taxas são determinadas usando um espectrofotômetro no modo de comprimento de onda duplo com medições contínuas (mais de 1 min a cada 1,5 min). Após 45 min, 60 μl (contendo 60 unidades) de SOD são adicionados e o ensaio continua por mais 45 min.

Descobriu-se que o arNOX salivar é um método conveniente e não invasivo para monitorar os níveis de arNOX em ensaios clínicos de intervenção da coenzima Q10 com níveis de resposta paralelos aos observados com arNOX sérico e celular (Morre e Morre 2008).

População do estudo

Um total de 54 pacientes do sexo feminino que desejam engravidar serão incluídos neste estudo no TCART-Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology. Cada sujeito deve atender aos critérios de inclusão e exclusão do estudo

Cálculo de potência:

Um total de 54 pacientes entrará neste estudo de desenho paralelo de dois tratamentos. A probabilidade é de 90% de que o estudo detecte uma diferença de tratamento bilateral com valor p ≤ 0,01, se a verdadeira diferença entre os tratamentos na taxa de aneuploidia for de 25%. Isso se baseia na suposição de que o desvio padrão da variável de resposta é 0,180.

Atribuição ao tratamento e randomização:

Os pacientes serão designados em ordem cronológica no dia da inscrição no estudo para uma randomização gerada por computador. Cada participante inscrito receberá um pacote pré-atribuído contendo placebo ou CoQ10 durante o estudo. O médico será cegado quanto à designação dos pacientes. A randomização será feita antes de iniciar o primeiro ciclo.

Os investigadores manterão um registro separado relacionando os nomes dos sujeitos aos seus números de código, para facilitar a verificação dos dados nos arquivos dos sujeitos quando necessário.

A análise estatística será feita com o teste t de Student para camper entre o tratamento e o grupo placebo para todas as medidas de resultado. A análise de poder foi calculada para alfa < 0,01.

Resultados antecipados e possíveis armadilhas. O número de pacientes necessários para o estudo é razoável e não esperamos que seja um obstáculo. Se os resultados deste estudo forem para o estudo animal, poderemos mostrar uma diferença significativa no número de embriões euplóides entre os grupos de teste e controle, bem como com os outros parâmetros de resultado. Trabalhamos há vários meses com o laboratório de microarray da UHN para otimizar o uso do kit Advalytics multiplex PCR, que atualmente funciona muito bem. Não esperamos nenhum problema com este componente do objeto.