Effekten af ​​co-enzym Q10 sammen med fertilitetsmedicin på graviditetsresultatet af in vitro fertilisering (CoQ10-IVF)

Formålet med denne undersøgelse er at evaluere effektiviteten af ​​CoQ10-administration med hensyn til dens effekt på hastigheden af ​​aneuploidi af oocytter og kumulativ levende fødselsrate.

Studiedesign Dette er en prospektiv randomiseret placebokontrolleret undersøgelse. Studiedeltagere vil gennemgå op til 3 cyklusser som en del af denne protokol. Alle kliniske vurderinger vil blive udført på de deltagende infertilitetsklinikker.

Undersøgelsen vil blive organiseret på ambulant basis på Toronto Center for Advanced Reproductive Technology (TCART). Undersøgelsen vil involvere 54 kvinder i alderen 35-43 år i IVF-behandling. Alle kvinder vil opsamle 2 ml spyt i et 5 ml polyethylenrør til baseline-måling af coQ10-aktivitet ved arNOX-assay (beskrevet nedenfor).

Studiedeltagere vil blive tilfældigt tildelt enten placebo- eller COQ10-kapsler (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD-registreringskoder 135307). Undersøgelsesdeltagere vil tage 600 mg CoQ10 oralt én gang dagligt med morgenmad eller identiske placebokapsler i 2 måneder før en IVF-cyklus og op til 3 cyklusser, hvis graviditet ikke forekommer. På cyklusdag 3 vil forsøgspersonerne starte ovariestimuleringen til in vitro fertilisering, mens de fortsætter med at indtage kosttilskuddene. Den kontrollerede ovariestimulation (COH) vil bestå af mikrodosis GnRH agonist flare protokol, som er klinikkens standard protokol for ældre kvinder. COH vil blive udført ved hjælp af rekombinant FSH (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Canada) eller humane menopausale gonadotropiner (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Canada) 150 enheder to gange dagligt S.C. og Buserelin Acetate (Superfact, Sanofi) -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg subkutant B.I.D, og ​​vil fortsætte indtil dagen før 10.000 enheder humant choriongonadotropin (hCG) (Pregnyl, Organon). Dosis vil ikke blive ændret og skal bibeholdes i hele undersøgelsens varighed. Begge lægemidler vil fortsætte dagligt, indtil follikulær udvikling anses for tilstrækkelig (mindst 3 follikler >17 mm, og E2-niveauet er acceptabelt for antallet af tilstedeværende follikler), på hvilket tidspunkt hCG'et vil blive injiceret for at udløse den endelige follikulær modning. Oocytudtagning vil ske 36 timer senere ved vaginal ultralydsstyret nålespiration og med brug af lokalbedøvelse og mild sedation. På udtagningstidspunktet vil forsøgspersoner opsamle 2 ml spyt, derudover vil 2 ml follikelvæske blive opsamlet fra den første follikel, som aspireres fra hver æggestok til bestemmelse af coQ10-aktivitet ved arNOX-assay. DA det ikke er muligt at måle CoQ10-niveauer i en enkelt celle (f.eks. oocytter), repræsenterer FF direkte cellulært miljø, der kan afspejle denne celles metaboliske profil. Efter udtagning vil oocytterne blive befrugtet med ICSI for ikke at kontaminere moderens DNA under en polær kropsbiopsiprøve med sæd-DNA. Den følgende dag vil alle oocytterne med 2 prokerner gennemgå en biopsi af en eller begge polære legemer.

Polær kropsbiopsi. Oocytten insemineres derefter ved hjælp af intracytoplasmatisk sæd-injektion (ICSI) teknikken og opbevares i kultur i en inkubator. For at biopsi det polære legeme holdes oocytten af ​​holdepipetten med den polære krop i klokken 11-12-positionen. Der laves en åbning i zona pellucida og en poleret glasnål indføres i perivitellinerummet, og den polære krop fjernes forsigtigt.

Embryonoverførslen udføres om morgenen den tredje dag efter ægudtagning.

Polære legemer vaskes i dråber af isotonisk HEPES-pufret saltvand og overføres derefter til hypotonisk opløsning, fikseres i methanol: eddikesyre på et objektglas og dehydreres i methanol til yderligere genetisk analyse. Hele proceduren påvirker hverken befrugtnings- eller spaltningshastigheden i biopsiede oocytter negativt, da den polære krop ikke er involveret i ovenstående processer.Karyotyping:

De polære legemer vil blive overført til UHN-mikroarray-centret til kromosomantalbestemmelse. Analysen vil blive udført med et kommercielt sæt fra Advalytix (Olympus Life Science Research, München, Tyskland). Dette er et multipleks PCR-baseret kit, der giver en hurtig og nøjagtig optælling af alle 23 kromosomer og er skræddersyet til kromosomtal i polær krop. Efter 2 dage vil et enkelt embryo med en normal karyotype blive overført til livmoderhulen under ultralydsvejledning ved hjælp af et Cook-overførselskateter (Cook, Sidney, Australien). Resten af ​​de levedygtige embryoner med en normal karyotype vil blive frosset (langsom nedfrysning). Luteal støtte vil bestå af progesteron suppositorier 100mg (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario Canada) vaginalt 3 gange dagligt startende på overførselsdagen og vil fortsætte i 2 uger indtil slutningen af ​​hver cyklus, når serum beta hCG vil blive udtaget, og hvis gravid , CoQ10/placebo vil blive afbrudt. Hvis du er gravid, vil luteal støtte fortsætte indtil 10 ugers graviditet. Hvis patienten ikke er gravid, vil hun have en cyklus med endometriestimulering med mikroniseret østradiol, efterfulgt af progesteron, når en tilstrækkelig endometrietykkelse er blevet målt. Fire dage efter vil 1-2 embryoner blive optøet og overført. Luteal støtte vil omfatte østradiol og progesteron, som opretholdes i op til 10 uger, hvis du er gravid. Disse cyklusser af frosset embryooverførsel vil blive fortsat, så længe der er frosne embryoner fra samme udtagning.

Studiets endepunkter vil være:

1. Primært resultatmål vil være antallet og procentdelen af ​​euploide æg pr. udtagning

2. Sekundære resultatmål vil omfatte:

   • Ovariel reaktion
   • Embryo kvalitet
   • Akkumuleret graviditetsrate / hentning
   • Akkumuleret levende fødselsrate / hentning
   • CoQ10-aktivitet i spyt og follikelvæske ved arNOX-assay

Coenzym Q10-assay arNOX er et coenzym Q10-hæmmet, aldringsrelateret eksternt NADH-oxidase (ECTO-NOX) protein på celleoverfladen, som også er til stede i sera og spyt. Det er i stand til superoxiddannelse målt som superoxiddismutase-hæmmet reduktion af ferricytochrome c (oxideret cytochrom C). arNOX-aktiviteten af ​​spyt hos ældre individer hæmmes af coenzym Q10. Aktiviteten opstår først efter 30 års alderen til et næsten maksimum omkring 55 år.

arNOX-aktivitet analyseres ud fra målinger af superoxidproduktion baseret på standardmetoden, hvor reduktion af ferricytokrom c med superoxid overvåges fra stigningen i absorbans ved 550 nm med reference ved 540 nm. Som en yderligere kontrol for specificiteten af ​​arNOX-aktiviteten tilsættes superoxiddismutase (SOD) nær slutningen af ​​assayet for at sikre, at hastigheden vendte tilbage til basislinjen. Assayet består af 150 μl (2 mg/ml) oxideret ferricytochrome c-opløsning og 200 μl spyt tilsat 2,5 ml assaybuffer (8,06 g NaC1, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g KH2,1PO30, CaCl0,1PO30. g MgCl2, 1,35 g glucose opløst i 1000 ml deioniseret vand, justeret til pH 7,4, filtreret og opbevaret ved 4◦C). Hastighederne bestemmes ved hjælp af et spektrofotometer i dobbeltbølgelængdetilstand med kontinuerlige målinger (over 1 min. hvert 1,5 min.). Efter 45 min tilsættes 60 μl (indeholdende 60 enheder) SOD, og ​​analysen fortsættes i yderligere 45 min.

Spyt-arNOX viste sig at være en bekvem og ikke-invasiv metode til at overvåge arNOX-niveauer i kliniske coenzym Q10-interventionsforsøg med responsniveauer, der er parallelle med dem, der ses med serum og cellulær arNOX (Morre og Morre 2008).

Studiepopulation

I alt 54 kvindelige patienter, der ønsker at blive gravide, vil blive tilmeldt denne undersøgelse ved TCART-Toronto Center for Advanced Reproductive Technology. Hvert emne skal opfylde undersøgelsens inklusions- og eksklusionskriterier

Effektberegning:

I alt 54 patienter vil deltage i dette paralleldesignede to-behandlingsstudie. Sandsynligheden er 90 procent for, at undersøgelsen vil opdage en behandlingsforskel ved en tosidet med p-værdi ≤ 0,01, hvis den sande forskel mellem behandlingerne i aneuploidirate er 25 %. Dette er baseret på antagelsen om, at standardafvigelsen for svarvariablen er 0,180.

Tildeling til behandling og randomisering:

Patienter vil blive tildelt i kronologisk rækkefølge på dagen for studietilmelding til en computergenereret randomisering. Hver tilmeldt deltager modtager en forudtildelt pakke indeholdende enten placebo eller CoQ10 i hele undersøgelsens varighed. Lægen vil være blind med hensyn til tildelingen af ​​patienterne. Randomisering vil blive udført før start af den første cyklus.

Efterforskerne vil føre en separat registrering, der relaterer navnene på forsøgspersonerne til deres kodenumre, for at tillade nem kontrol af data i emnefiler, når det er nødvendigt.

Statistisk analyse vil blive udført med elev t-test til camper mellem behandlings- og placebogruppen for alle resultatmålene. Effektanalyse blev beregnet for alfa < 0,01.

Forventede resultater og potentielle faldgruber. Antallet af patienter, der skal til undersøgelsen, er rimeligt, og vi forventer ikke, at det vil være en hindring. Hvis resultaterne i denne undersøgelse vil være til dyreforsøget, skulle vi være i stand til at vise en signifikant forskel i antallet af euploide embryoner mellem test- og kontrolgrupperne, såvel som med de andre udfaldsparametre. Vi har arbejdet i flere måneder med UHN microarray lab for at optimere brugen af ​​Advalytics multiplex PCR kit, som i øjeblikket fungerer meget godt. Vi forventer ingen problemer med denne komponent af objektet.