Het effect van co-enzym Q10 samen met vruchtbaarheidsmiddelen op de zwangerschapsuitkomst van in-vitrofertilisatie (CoQ10-IVF)

Het doel van deze studie is om de werkzaamheid van CoQ10-toediening te evalueren met betrekking tot het effect ervan op de mate van aneuploïdie van oöcyten en het cumulatieve aantal levendgeborenen.

Studieopzet Dit is een prospectieve, gerandomiseerde, placebogecontroleerde studie. Studiedeelnemers ondergaan maximaal 3 cycli als onderdeel van dit protocol. Alle klinische beoordelingen worden uitgevoerd in de deelnemende onvruchtbaarheidsklinieken.

De studie zal poliklinisch worden georganiseerd in het Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology (TCART). Bij de studie zullen 54 vrouwen van 35-43 jaar betrokken zijn die een IVF-behandeling ondergaan. Alle vrouwen verzamelen 2 ml speeksel in een polyethyleen buis van 5 ml voor basislijnmeting van de coQ10-activiteit door middel van een arNOX-assay (hieronder beschreven).

Studiedeelnemers worden willekeurig toegewezen aan placebo of COQ10-capsules (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD-registratiecodes 135307). Studiedeelnemers zullen 600 mg CoQ10 eenmaal daags oraal innemen bij het ontbijt of identieke placebo-capsules gedurende 2 maanden voorafgaand aan een IVF-cyclus en tot 3 cycli als er geen zwangerschap optreedt. Op cyclusdag 3 beginnen proefpersonen met de ovariële stimulatie voor in-vitrofertilisatie, terwijl ze doorgaan met het consumeren van de supplementen. De gecontroleerde ovariële stimulatie (COH) zal bestaan ​​uit het microdosis GnRH-agonist flare-protocol, het standaardprotocol van de kliniek voor oudere vrouwen. COH zal worden gedaan met behulp van recombinant FSH (Puregon; Schering-Plough Inc.,Mississauga, ON, Canada) of menselijke menopauzale gonadotropines (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Canada) 150 eenheden tweemaal daags S.C. en Busereline-acetaat (Superfact, Sanofi -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg subcutaan B.I.D, en zal doorgaan tot de dag voorafgaand aan 10.000 eenheden humaan choriongonadotrofine (hCG) (Pregnyl, Organon). De dosering zal niet worden gewijzigd en moet worden gehandhaafd gedurende de duur van het onderzoek. Beide geneesmiddelen zullen dagelijks worden voortgezet totdat de folliculaire ontwikkeling voldoende wordt geacht (ten minste 3 follikels > 17 mm en het E2-niveau is acceptabel voor het aantal aanwezige follikels), waarna het hCG zal worden geïnjecteerd om de uiteindelijke folliculaire rijping op gang te brengen. De eicelpunctie zal 36 uur later worden uitgevoerd door middel van vaginale echogeleide naaldaspiratie en met behulp van lokale anesthesie en milde sedatie. Op het moment van ophalen verzamelen proefpersonen 2 ml speeksel, daarnaast wordt 2 ml folliculaire vloeistof verzameld uit de eerste follikel die uit elke eierstok wordt geaspireerd voor bepaling van coQ10-activiteit door middel van een arNOX-assay. Aangezien het niet mogelijk is om CoQ10-niveaus in een enkele cel te meten (bijv. eicellen), vertegenwoordigt FF de directe cellulaire omgeving die het metabolische profiel van deze cel kan weerspiegelen. Na het ophalen zullen de oöcyten worden bevrucht met ICSI om het maternale DNA tijdens het poollichaambiopsiemonster niet te besmetten met sperma-DNA. De volgende dag zullen alle eicellen met 2 pronuclei een biopsie ondergaan van een of beide poollichaampjes.

Biopsie van het polaire lichaam De eicel wordt vervolgens geïnsemineerd met behulp van de intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)-techniek en wordt in cultuur gehouden in een couveuse. Om het poollichaampje te biopseren, wordt de oöcyt vastgehouden door de houderpipet met het poollichaampje op de 11-12 uur positie. Er wordt een opening gemaakt in de zona pellucida en een gepolijste glazen naald wordt in de perivitelline-ruimte gebracht en het poollichaampje wordt voorzichtig verwijderd.

De embryotransfer wordt uitgevoerd op de ochtend van de derde dag na het ophalen van de eieren.

Polaire lichamen worden gewassen in druppeltjes isotone HEPES-gebufferde zoutoplossing en vervolgens overgebracht naar een hypotone oplossing, gefixeerd in methanol: azijnzuur op een glasplaatje en gedehydrateerd in methanol voor verdere genetische analyse. De hele procedure heeft geen nadelige invloed op de bevruchting of splitsingssnelheden in gebiopteerde oöcyten, aangezien het poollichaampje niet betrokken is bij de bovengenoemde processen. Karyotypering:

De poollichaampjes zullen worden overgebracht naar het UHN-microarraycentrum voor bepaling van het aantal chromosomen. De analyse zal worden uitgevoerd met een commerciële kit van Advalytix (Olympus Life Science Research, München, Duitsland). Dit is een op multiplex PCR gebaseerde kit die zorgt voor een snelle en nauwkeurige telling van alle 23 chromosomen en is afgestemd op het aantal chromosomen in het poollichaam. Na 2 dagen wordt een enkel embryo met een normaal karyotype onder echogeleide naar de baarmoederholte overgebracht met behulp van een Cook-overdrachtskatheter (Cook, Sidney, Australië). De rest van de levensvatbare embryo's met een normaal karyotype wordt ingevroren (Slow freezing). Luteale ondersteuning zal bestaan ​​uit zetpillen met progesteron 100 mg (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario, Canada) 3 keer per dag vaginaal vanaf de dag van overdracht en zal gedurende 2 weken worden voortgezet tot het einde van elke cyclus wanneer serum bèta-hCG wordt afgenomen en als u zwanger bent , wordt CoQ10/placebo stopgezet. Als u zwanger bent, gaat de luteale ondersteuning door tot 10 weken zwangerschap. Als de patiënte niet zwanger is, krijgt ze een cyclus van endometriumstimulatie met gemicroniseerd oestradiol, gevolgd door progesteron zodra voldoende endometriumdikte is gemeten. Vier dagen later worden 1-2 embryo's ontdooid en teruggeplaatst. Luteale ondersteuning omvat oestradiol en progesteron, die tot 10 weken worden gehandhaafd als u zwanger bent. Deze cycli van terugplaatsing van ingevroren embryo's worden voortgezet zolang er nog ingevroren embryo's uit dezelfde terugwinning zijn.

De studie-eindpunten zullen zijn:

1. Primaire uitkomstmaat is het aantal en percentage euploïde eieren per ophaalactie

2. Secundaire uitkomstmaten omvatten:

   • Ovariële reactie
   • Embryo kwaliteit
   • Cumulatief zwangerschapspercentage / ophalen
   • Cumulatief levend geboortecijfer / ophalen
   • CoQ10-activiteit in speeksel en folliculair vocht door arNOX-test

Co-enzym Q10-assay arNOX is een co-enzym Q10-geremd, verouderingsgerelateerd extern NADH-oxidase (ECTO-NOX) eiwit van het celoppervlak dat ook aanwezig is in sera en speeksel. Het is in staat superoxide te genereren, gemeten als superoxide-dismutase-geremde reductie van ferricytochroom c (geoxideerd cytochroom C). arNOX-activiteit van speeksel van oudere personen wordt geremd door co-enzym Q10. De activiteit verschijnt voor het eerst na de leeftijd van 30 tot een bijna maximum rond de leeftijd van 55 jaar.

arNOX-activiteit wordt bepaald aan de hand van metingen van superoxideproductie op basis van de standaardmethode waarbij reductie van ferricytochroom c door superoxide wordt gevolgd aan de hand van de toename in absorptie bij 550 nm met referentie bij 540 nm. Als verdere controle op de specificiteit van de arNOX-activiteit wordt superoxidedismutase (SOD) toegevoegd tegen het einde van de assay om te verzekeren dat de snelheid terugkeerde naar de basislijn. De test bestaat uit 150 μl (2 mg/ml) geoxideerde ferricytochroom c-oplossing en 200 μl speeksel toegevoegd aan 2,5 ml testbuffer (8,06 g NaC1, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g KH2PO4, 0,13 g CaCl2, 0,1 g g MgCl2, 1,35 g glucose opgelost in 1000 ml gedeïoniseerd water, ingesteld op pH 7,4, gefilterd en bewaard bij 4◦C). Snelheden worden bepaald met behulp van een spectrofotometer in de dubbele golflengtemodus met continue metingen (meer dan 1 minuut per 1,5 minuut). Na 45 minuten wordt 60 µl (bevattend 60 eenheden) SOD toegevoegd en wordt de assay nog eens 45 minuten voortgezet.

ArNOX uit speeksel bleek een gemakkelijke en niet-invasieve methode te zijn om arNOX-niveaus te controleren in klinische co-enzym Q10-interventieonderzoeken, waarbij de responsniveaus vergelijkbaar waren met die van serum en cellulair arNOX (Morre en Morre 2008).

Studie bevolking

In totaal zullen 54 vrouwelijke patiënten met een zwangerschapswens worden opgenomen in deze studie bij het TCART-Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology. Elk onderwerp moet voldoen aan de inclusie- en exclusiecriteria voor studies

Vermogensberekening:

In totaal zullen 54 patiënten deelnemen aan deze studie met twee parallelle ontwerpen. De kans is 90 procent dat de studie een behandelingsverschil detecteert bij een tweezijdige met p-waarde ≤ 0,01, als het werkelijke verschil tussen de behandelingen in aneuploïdiepercentage 25% is. Hierbij wordt ervan uitgegaan dat de standaarddeviatie van de responsvariabele 0,180 is.

Toewijzing aan behandeling en randomisatie:

Patiënten zullen op de dag van inschrijving in de studie in chronologische volgorde worden toegewezen aan een door de computer gegenereerde randomisatie. Elke ingeschreven deelnemer ontvangt een vooraf toegewezen pakket met placebo of CoQ10 voor de duur van het onderzoek. De arts zal geblindeerd zijn wat betreft de toewijzing van de patiënten. Randomisatie vindt plaats voorafgaand aan het starten van de eerste cyclus.

De onderzoekers houden een apart register bij waarin de namen van de proefpersonen worden gekoppeld aan hun codenummers, zodat indien nodig de gegevens in de proefpersonendossiers gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd.

Statistische analyse zal worden gedaan met student t-test om te kamperen tussen de behandelings- en placebogroep voor alle uitkomstmaten. Poweranalyse werd berekend voor alfa < 0,01.

Verwachte resultaten en mogelijke valkuilen. Het aantal patiënten dat nodig is voor de studie is redelijk en we verwachten niet dat dit een obstakel zal zijn. Als de resultaten in deze studie overeenkomen met de dierstudie, zouden we een significant verschil moeten kunnen aantonen in het aantal euploïde embryo's tussen de test- en controlegroep, evenals met de andere uitkomstparameters. We werken al enkele maanden samen met het UHN microarray lab om het gebruik van de Advalytics multiplex PCR-kit, die momenteel erg goed werkt, te optimaliseren. We verwachten geen problemen met dit onderdeel van het object.