辅酶Q10联合生育药物对体外受精妊娠结局的影响 (CoQ10-IVF)

本研究的目的是评估辅酶 Q10 给药对卵母细胞非整倍体率和累积活产率的影响。

研究设计 这是一项前瞻性随机安慰剂对照研究。 作为本协议的一部分，研究参与者将接受最多 3 个周期。 所有临床评估都将在参与的不孕不育诊所进行。

该研究将在多伦多高级生殖技术中心 (TCART) 以门诊形式进行。 该研究将涉及 54 名年龄在 35-43 岁之间接受试管婴儿治疗的女性。 所有女性将在 5 mL 聚乙烯管中收集 2 mL 唾液，用于通过 arNOX 测定法（如下所述）对辅酶 Q10 活性进行基线测量。

研究参与者将被随机分配到安慰剂或 COQ10 胶囊（AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD 注册码 135307）。 研究参与者将每天一次口服 600 毫克辅酶 Q10，含早餐或相同的安慰剂胶囊，持续 2 个月，然后再进行 IVF 周期，如果未怀孕，则最多服用 3 个周期。 在周期第 3 天，受试者将开始体外受精的卵巢刺激，同时继续服用补充剂。 受控卵巢刺激 (COH) 将包括微剂量 GnRH 激动剂耀斑方案，这是诊所针对老年女性的标准方案。 COH 将使用重组 FSH（Puregon；Schering-Plough Inc.，Mississauga，ON，Canada）或人绝经期促性腺激素（Menopur，Ferring Inc，Oakville，ON，Canada）150 单位每天两次 S.C. 和 Buserelin Acetate（Superfact，Sanofi -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0.05 mg 皮下注射 B.I.D，并将持续至 10,000 单位人绒毛膜促性腺激素 (hCG)（Pregnyl，Organon）前一天。 剂量不会改变，必须在研究期间保持不变。 这两种药物将每天持续使用，直到认为卵泡发育足够（至少 3 个卵泡 > 17 mm，并且 E2 水平对于存在的卵泡数量是可接受的），此时将注射 hCG 以触发最终的卵泡成熟。 卵母细胞取出将在 36 小时后通过阴道超声引导的针吸并使用局部麻醉和轻度镇静来完成。 在检索时，受试者将收集 2 mL 唾液，此外，将从每个卵巢吸出的第一个卵泡中收集 2 mL 卵泡液，用于通过 arNOX 测定法测定辅酶 Q10 活性。 因为不可能测量单个细胞中的辅酶 Q10 水平（例如 卵母细胞), FF 代表直接细胞环境, 可以反映该细胞的代谢概况。 取出后，卵母细胞将通过 ICSI 受精，以免极体活检样本中的精子 DNA 污染母体 DNA。 第二天，所有具有 2 个原核的卵母细胞将接受一个或两个极体的活检。

极体活检然后使用卵胞浆内单精子注射 (ICSI) 技术对卵母细胞进行授精，并将其保存在培养箱中。 为了对极体进行活组织检查，卵母细胞由固定吸管固定，极体位于 11-12 点钟位置。 在透明带上开一个口，将抛光玻璃针插入卵周间隙，小心取出极体。

胚胎移植在取卵后第三天早上进行。

极体在等渗 HEPES 缓冲盐水液滴中洗涤，然后转移到低渗溶液中，固定在甲醇：载玻片上的乙酸中，并在甲醇中脱水以进行进一步的遗传分析。 整个过程不会对活检卵母细胞的受精率或卵裂率产生不利影响，因为极体不参与上述过程。核型分析：

极体将被转移到 UHN 微阵列中心进行染色体数目测定。 分析将使用来自 Advalytix（Olympus Life Science Research，Munich，Germany）的商业试剂盒完成。 这是一种基于多重 PCR 的试剂盒，可对所有 23 条染色体进行快速准确的计数，并专为极体染色体计数量身定制。 2 天后，将使用 Cook 转移导管（Cook，Sidney，Australia）在超声引导下将具有正常核型的单个胚胎转移到子宫腔。 其余具有正常核型的可存活胚胎将被冷冻（慢速冷冻）。 黄体支持将包括黄体酮栓剂 100 毫克（Kingsway Pharmacy，加拿大安大略省多伦多市）阴道给药，从转移当天开始，每天 3 次，持续 2 周，直到每个周期结束时抽取血清 β hCG 并且如果怀孕, CoQ10/安慰剂将停产。 如果怀孕，黄体支持将持续到妊娠 10 周。 如果患者未怀孕，她将使用微粉化雌二醇进行子宫内膜刺激，一旦测量到足够的子宫内膜厚度，随后使用黄体酮。 四天后，将解冻并移植 1-2 个胚胎。 黄体支持将包括雌二醇和黄体酮，如果怀孕，它们将维持长达 10 周。 只要有来自同一次取回的冷冻胚胎，冷冻胚胎移植的这些循环就会继续。

研究终点将是：

1. 主要结果指标将是每次检索的整倍体卵子的数量和百分比

2. 次要成果措施将包括：

   • 卵巢反应
   • 胚胎质量
   • 累计妊娠率/检索
   • 累计活产率/检索
   • 通过 arNOX 测定唾液和卵泡液中的辅酶 Q10 活性

辅酶 Q10 测定 arNOX 是一种辅酶 Q10 抑制的、与衰老相关的细胞表面外部 NADH 氧化酶 (ECTO-NOX) 蛋白，也存在于血清和唾液中。 它能够产生超氧化物，测量为超氧化物歧化酶抑制铁细胞色素 c（氧化细胞色素 C）的还原。辅酶 Q10 抑制老年人唾液中的 arNOX 活性。 这种活动首先出现在 30 岁之后，大约在 55 岁时接近最大值。

arNOX 活性是根据标准方法测量超氧化物产生来测定的，其中超氧化物对铁细胞色素 c 的还原是根据 550 nm 吸光度的增加以及 540 nm 的参考来监测的。 作为对 arNOX 活性特异性的进一步检查，在分析接近尾声时添加超氧化物歧化酶 (SOD) 以确定速率恢复到基线。 该测定由 150 μl（2 mg/ml）氧化铁细胞色素 c 溶液和 200 μl 唾液添加到 2.5 ml 测定缓冲液（8.06 g NaCl、0.2 g KCl、0.18 g Na·2HPO4、0.26 g KH2PO4、0.13 g CaCl2、0.1 g MgCl2，1.35 g 葡萄糖溶解于 1000 ml 去离子水中，调节 pH 至 7.4，过滤并在 4°C 下储存）。 使用分光光度计在双波长模式下连续测量（每 1.5 分钟超过 1 分钟）来确定速率。 45 分钟后，添加 60 μl（含 60 个单位）SOD，并继续进行另外 45 分钟的测定。

在临床辅酶 Q10 干预试验中，发现唾液 arNOX 是一种方便且非侵入性的监测 arNOX 水平的方法，其反应水平与血清​​和细胞 arNOX 的反应水平相当（Morre 和 Morre 2008）。

研究人群

共有 54 名希望怀孕的女性患者将参加 TCART-多伦多高级生殖技术中心的这项研究。 每个受试者必须符合研究纳入和排除标准

功率计算：

共有 54 名患者将进入这两项治疗平行设计研究。 如果非整倍体率处理之间的真实差异为 25%，则研究将在 p 值 ≤ 0.01 的两侧检测到处理差异的概率为 90%。 这是基于响应变量的标准差为 0.180 的假设。

分配治疗和随机化：

患者将在研究登记当天按时间顺序分配到计算机生成的随机化。 在研究期间，每个登记的参与者将收到一个预先分配的包裹，其中包含安慰剂或辅酶 Q10。 医生将不知道患者的分配。 随机化将在开始第一个周期之前完成。

研究人员将单独记录受试者姓名与其代码编号，以便在需要时轻松检查受试者文件中的数据。

将通过学生 t 检验对治疗组和安慰剂组之间的露营者进行所有结果测量的统计分析。 针对 alpha < 0.01 计算功效分析。

预期的结果和潜在的陷阱。 该研究所需的患者数量是合理的，我们预计这不会成为障碍。 如果这项研究的结果将用于动物研究，我们应该能够显示测试组和对照组之间整倍体胚胎数量以及其他结果参数的显着差异。 我们已经与 UHN 微阵列实验室合作了几个月，以优化 Advalytics 多重 PCR 试剂盒的使用，该试剂盒目前运行良好。 我们预计对象的这个组件不会有任何问题。